大鼠骨髓间充干分化来源的内皮祖细胞的鉴定标准！

大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）分化来源的内皮祖细胞（EPCs）鉴定需遵循「表型特征 + 功能特性」双验证原则，二者缺一不可，以此确保细胞的内皮分化潜能和功能活性。具体鉴定标准如下：

一、细胞形态学鉴定（直观初筛）

诱导培养 7-14 天后，通过倒置显微镜观察细胞形态变化：

早期（1-5 天）：细胞由 rBMSCs 的梭形逐渐转变为小圆形、鹅卵石样，出现细胞集落。

中期（5-10 天）：集落扩大，细胞间连接紧密，部分细胞伸出细长伪足，形成线状排列。

成熟期（10-14 天）：细胞呈典型的纺锤形或铺路石样，在 Matrigel 基质胶上可自发形成管腔样网状结构，这是内皮细胞的标志性形态。

二、表面标志物表型鉴定（流式细胞术/免疫荧光）

EPCs 兼具干细胞标志物和内皮细胞标志物的表达，需通过特异性抗体检测：

检测方法        核心标志物       结果判定标准

流式细胞术  干细胞标志物：CD133、CD34、VEGFR-2（FLK-1） 内皮细胞标志物：CD31、VE-cadherin、vWF 排除标志物：CD45（造血细胞）、CD11b（巨噬细胞）  诱导后 CD133阳性率约 40%-60%，CD34约 30%-40%，VEGFR-2约 35%-45%；内皮标志物阳性率需＞50%，排除标志物阳性率＜5%

免疫荧光染色  CD31、VE-cadherin、vWF  荧光信号定位于细胞膜或细胞质，阳性细胞占比＞60%；vWF 表现为细胞质内点状荧光（特征性分布）

三、功能特性鉴定（金标准）

表型鉴定合格后，需进一步验证细胞的内皮功能，这是区分成熟内皮细胞与 EPCs 功能活性的关键：

双荧光吞噬结合实验

原理：EPCs 可特异性吞噬乙酰化低密度脂蛋白，并结合荆豆凝集素 1。

操作：将诱导后的细胞与 DiL-ac-LDL（37孵育 4h）和 FITC-UEA-1（室温孵育 1h）共孵育，荧光显微镜下观察。

判定：双阳性细胞（红色 + 绿色荧光）占比≥70% 为功能合格的 EPCs。

Matrigel 基质胶管腔形成实验

操作：将 Matrigel 胶铺于 24 孔板，待胶凝固后接种 1×10 个 EPCs，培养 6-12h 后镜检。

判定：细胞可形成连续、完整的管状网络结构，计数管腔分支点数≥20 个/视野（200×）为阳性。

体外血管生成相关功能（可选）

增殖迁移能力：通过 CCK-8、Transwell 实验检测，EPCs 在 VEGF 刺激下增殖率和迁移率显著升高。

分泌功能：可分泌 VEGF、bFGF 等促血管生成因子，通过 ELISA 检测验证。

四、电镜超微结构鉴定（进阶验证）

透射电镜下观察，EPCs 细胞质内可见小体，这是内皮细胞特有的细胞器，呈长杆状、有膜包被，内含因子，是鉴定内皮源性细胞的特异性超微结构标志。

关键质控要点

需设置未诱导 rBMSCs 对照组，对照组应不表达或低表达内皮标志物，且无管腔形成能力。

流式检测需设置同型对照，排除非特异性结合干扰。

功能实验中，Matrigel 胶需全程冰上操作，避免提前凝固影响实验结果。

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