氯化钠血琼脂基础培养基的检验原理与使用方法及注意事项！

 

氯化钠血琼脂基础培养基是在普通血琼脂基础上添加特定浓度氯化钠（通常为 6.5%）制成的选择性兼鉴别培养基，核心用途是筛选耐高盐细菌（如肠球菌、葡萄球菌等），并通过“溶血反应”鉴别细菌的产酶特性，广泛应用于临床微生物检验和食品卫生检测。

 

一、检验原理

 

该培养基的设计基于细菌的耐高盐特性和溶血能力两大核心生理差异，原理可拆解为“营养供给”“选择性抑制”“鉴别反应”三部分：

 

1、营养供给：满足细菌基础生长需求

 

氯化钠血琼脂基础的“基础成分”为细菌提供全面营养，与普通营养琼脂类似，关键成分及作用如下：

 

核心成分        作用机制

 

胰蛋白胨/肉浸粉 提供蛋白质水解产物、核苷酸等，作为细菌生长的氮源和碳源基础

 

酵母浸粉 补充 B 族维生素、生长因子，促进营养苛求菌（如某些链球菌）增殖

 

葡萄糖 提供可发酵糖类，为细菌代谢提供能量（部分细菌可通过发酵葡萄糖产酸，辅助鉴别）

 

琼脂    培养基凝固剂，提供固体生长表面，便于观察菌落形态

 

2、选择性抑制：筛选耐高盐细菌

 

通过添加6.5% 高浓度氯化钠，利用不同细菌对盐浓度的耐受差异实现选择性筛选：

 

多数非耐盐细菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌）对高盐敏感，6.5% 氯化钠会破坏其细胞膜渗透压平衡，导致细胞脱水破裂，无法生长；

 

耐高盐细菌（如肠球菌、金黄色葡萄球菌、某些弧菌）可通过调节细胞内渗透压（如积累相容性溶质）适应高盐环境，能在该培养基上正常繁殖，从而被筛选出来。

 

注：不同菌株耐盐性存在差异，例如肠球菌对 6.5% 氯化钠的耐受性强于链球菌（多数链球菌在该浓度下生长受抑），因此该培养基也是区分肠球菌与链球菌的重要工具之一。

 

3、鉴别反应：通过溶血试验区分细菌

 

培养基中添加的脱纤维羊血 / 兔血（通常为 5%~10%）不仅能补充营养（如血红蛋白、生长因子），还可通过“溶血反应”鉴别细菌是否产生溶血素（一种能破坏红细胞的毒素），具体溶血类型及判断标准如下：

 

溶血类型      原理     外观特征（菌落周围）   常见阳性菌举例

 

α- 溶血（不完全溶血） 细菌产生的溶血素仅能部分破坏红细胞，使血红蛋白转化为正铁血红蛋白 形成草绿色或灰绿色晕圈，红细胞未完全溶解，晕圈内仍可见未破裂的红细胞 肺炎链球菌、草绿色链球菌

 

β- 溶血（完全溶血） 细菌产生的溶血素能完全破坏红细胞和血红蛋白 形成透明无色的溶血环，红细胞完全溶解，培养基背景恢复为琼脂本身的颜色 金黄色葡萄球菌、A 群链球菌

 

γ- 溶血（不溶血） 细菌不产生溶血素，无法破坏红细胞 菌落周围无任何颜色变化，红细胞完整存在 肠球菌、表皮葡萄球菌

 

二、使用方法

 

氯化钠血琼脂基础培养基的使用需遵循“培养基制备→样本处理→接种培养→结果观察”流程，核心是保证血液添加的无菌性和培养条件的适宜性，具体步骤如下：

 

1、培养基制备（以干粉基础培养基为例）

 

称量与溶解：按说明书比例（如 1000mL 蒸馏水加 40g 干粉基础培养基），称取干粉于蒸馏水中，搅拌至完全溶解（可加热至沸腾助溶，确保无未溶颗粒，避免过度煮沸导致营养成分破坏）；

 

分装与灭菌：将溶解后的基础培养基分装至锥形瓶，加盖棉塞或硅胶塞，于121高压蒸汽灭菌 15min（灭菌后需快速冷却至 45~50，避免温度过高破坏后续添加的血液成分）；

 

无菌添加血液：在无菌操作台内，向冷却至 45~50的基础培养基中加入无菌脱纤维羊血 / 兔血（按 5%~10% 比例，如 100mL 基础培养基加 5~10mL 血液），轻轻混匀（避免剧烈摇晃产生气泡，影响菌落观察）；

 

倒平板与保存：将含血液的培养基倒入无菌培养皿（每皿约 15~20mL），待其自然凝固（室温静置 30~60min，或 4冷藏 30min 加速凝固），制成平板。制备好的平板需4密封冷藏保存，有效期一般不超过 7 天，使用前需恢复至室温。

 

2、样本处理（以临床标本为例，如尿液、伤口分泌物）

 

液体标本（如尿液）：若标本浑浊，可直接取 0.1mL 接种；若标本清亮，可先离心（3000rpm，5min），取沉淀（约 0.1mL）接种，提高检出率；

 

固体标本（如伤口分泌物、粪便）：用无菌棉签蘸取标本，在平板表面轻轻涂抹，或用无菌生理盐水将标本制成 1:10 稀释液后，取 0.1mL 接种；

 

食品标本（如肉制品）：称取 10g 样本，加入 90mL 无菌生理盐水，振荡混匀制成 1:10 稀释液，再按 10 倍梯度稀释至适宜浓度（如 10²~10，根据预期菌含量调整），取 0.1mL 稀释液接种。

 

3、接种与培养

 

接种方式：

 

若需分离单菌落（如鉴别菌株类型），采用“涂布法”：取 0.1mL 处理后的样本，滴加至平板表面，用无菌 L 型玻璃涂布棒均匀涂布整个平板，静置 5~10min 让液体吸收；

 

若需快速筛查（如判断是否存在耐高盐菌），可采用“划线法”：用无菌接种环蘸取样本，在平板上进行分区划线，培养后观察划线区域的菌落生长情况。

 

培养条件：将接种后的平板放入36±1恒温培养箱，需氧或微需氧培养 18~24h（多数耐高盐菌为需氧或兼性厌氧菌，如肠球菌、葡萄球菌；若怀疑为微需氧菌，可在 5% 二氧化碳环境中培养）；若菌落生长缓慢，可延长培养至 48h。

 

4、结果观察与判断

 

培养结束后，根据“菌落生长情况”和“溶血类型”综合判断结果：

 

耐高盐菌筛选结果：

 

阳性：平板上出现肉眼可见的菌落（无论溶血类型），说明样本中存在耐高盐细菌；

 

阴性：平板上无菌落生长或仅出现微小、稀疏的菌落（＜10 个），说明样本中无耐高盐菌或含量极低。

 

溶血类型鉴别：观察阳性菌落周围的溶血现象，结合菌落形态进一步判断菌株种类：

 

若菌落为圆形、凸起、表面光滑，周围有透明溶血环（β- 溶血），需警惕金黄色葡萄球菌（可进一步做凝固酶试验确认）；

 

若菌落为圆形、边缘整齐、乳白色，周围无溶血环（γ- 溶血），可能为肠球菌（可进一步做胆汁七叶苷试验确认）；

 

若菌落周围出现草绿色溶血环（α- 溶血），可能为耐高盐的草绿色链球菌（需结合生化反应排除其他菌株）。

 

5、关键注意事项

 

血液添加的无菌性：脱纤维血液需经无菌验证，添加过程必须在无菌操作台内进行，避免血液污染导致培养基失效；

 

温度控制：基础培养基灭菌后冷却至 45~50时才能添加血液，温度过高会导致红细胞破裂（出现“溶血背景”，干扰结果判断），温度过低则会导致培养基凝固，无法混匀；

 

培养基质量验证：每次使用前需做 3 项验证：

 

无菌验证：取空白平板培养，无任何菌落生长；

 

促生长验证：接种标准耐高盐菌（如粪肠球菌 ATCC 29212），需形成典型菌落；

 

抑制验证：接种非耐高盐菌（如大肠埃希菌 ATCC 25922），应无生长；

 

溶血结果判断时机：培养 18~24h 后及时观察，若培养时间过长，细菌代谢产物可能导致培养基颜色变化，干扰溶血环判断。

 

通过高盐选择性和溶血鉴别双重作用，氯化钠血琼脂基础培养基可快速筛选并初步鉴定耐高盐细菌，为临床感染诊断和食品微生物安全控制提供重要技术支撑。

 

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