支原体DNA提取的准备工作与操作步骤及注意事项！

 

 

百欧博伟生物：以下是支原体DNA提取的常规操作步骤（以实验室常用方法为例）：

 

一、实验前准备

 

1、材料与试剂：

 

支原体培养物（如SP4培养基培养的支原体菌液）。

 

裂解缓冲液（含SDS、蛋白酶K、EDTA等）。

 

酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）。

 

无水乙醇或异丙醇（用于DNA沉淀）。

 

TE缓冲液（pH 8.0）或无菌去离子水（溶解DNA）。

 

RNase A（可选，用于去除RNA）。

 

PBS缓冲液（用于洗涤菌体）。

 

2、仪器与耗材：

 

离心机、水浴锅/金属浴、微量移液器、离心管、无菌枪头等。

 

二、操作步骤

 

1、样本处理

 

支原体培养物：

 

取1-5 mL支原体培养液，12,000 ×g 离心10分钟（4），弃上清。

 

用1 mL PBS重悬菌体沉淀，再次离心，重复洗涤1-2次以去除培养基杂质。

 

临床样本（如细胞培养上清）：

 

若样本中支原体浓度低，需先通过0.22 μm滤膜过滤去除宿主细胞，再超速离心（如15,000 ×g，30分钟）浓缩菌体。

 

2、细胞裂解

 

向菌体沉淀中加入200 μL裂解缓冲液（含1% SDS和20 mg/mL蛋白酶K），涡旋混匀。

 

55水浴孵育1小时（或金属浴），每隔15分钟轻柔颠倒混匀。

 

（可选）加入1-2 μL RNase A（终浓度100 μg/mL），37孵育30分钟去除RNA。

 

3、DNA纯化

 

方法一：酚-氯仿抽提法

 

向裂解液中加入等体积酚-氯仿-异戊醇（约200 μL），涡旋混匀10秒。

 

12,000 ×g 离心10分钟（室温），小心吸取上层水相至新离心管。

 

重复酚-氯仿抽提1次。

 

加入等体积氯仿（去除残留酚），离心后取上层水相。

 

方法二：试剂盒法

 

（如使用商品化DNA提取试剂盒，按说明书操作）

 

将裂解液转移至吸附柱，离心后弃废液。

 

用漂洗液洗涤吸附柱2次，离心去除残留乙醇。

 

将吸附柱置于新离心管中，加入50-100 μL TE缓冲液或无菌水，静置1分钟后离心洗脱DNA。

 

4、DNA沉淀与溶解

 

向纯化后的水相中加入1/10体积3 M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积预冷无水乙醇（或等体积异丙醇），轻柔混匀。

 

-20静置30分钟至过夜，或干冰速冻5分钟。

 

12,000 ×g 离心15分钟（4），弃上清。

 

用70%乙醇洗涤沉淀2次，离心后倒置晾干（避免过度干燥）。

 

加入50-100 μL TE缓冲液或无菌水溶解DNA，55水浴10分钟促进溶解。

 

三、DNA质量检测

 

浓度与纯度：使用测定A260/A280比值（理想值1.8-2.0）。

 

完整性：琼脂糖凝胶电泳（1%胶），观察是否有清晰条带（支原体基因组DNA通常为弥散条带）。

 

四、注意事项

 

避免污染：实验全程使用无菌耗材，操作台用紫外灭菌；更换枪头避免交叉污染。

 

轻柔操作：支原体无细胞壁，裂解时避免剧烈涡旋，防止DNA断裂。

 

临床样本处理：若检测细胞培养物中的支原体污染，需先去除宿主细胞DNA。

 

储存：DNA短期保存于4，长期保存于-20或-80。

 

五、常见问题

 

DNA得率低：可能因裂解不彻底，可延长蛋白酶K消化时间或增加起始样本量。

 

RNA残留：增加RNase A处理步骤。

 

蛋白质污染：重复酚-氯仿抽提或优化漂洗步骤。

 

根据实验需求选择适合的纯化方法（传统抽提法成本低但步骤繁琐；试剂盒法快速但成本较高）。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！