志贺氏菌的活化与保存流程及鉴定方法与注意事项！

 

 

志贺氏菌（Shigella）是一种重要的肠道致病菌，其活化、保存及鉴定需遵循严格的生物安全规范（通常为生物安全二级）。以下是详细的实验流程和注意事项：

 

一、志贺氏菌的活化

 

1、活化前的准备

 

生物安全要求：在生物安全柜（BSC）中操作，穿戴防护服、手套和护目镜。

 

培养基选择：

 

非选择性培养基：营养琼脂（NA）或脑心浸液琼脂（BHI）。

 

选择性培养基：麦康凯琼脂、XLD琼脂（木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂）或SS琼脂（沙门氏菌-志贺氏菌选择培养基）。

 

2、活化步骤

 

冻干菌种：用无菌生理盐水或液体培养基复水，取100 μL涂布于平板，37培养18-24小时。

 

甘油冻存管：快速解冻，划线接种至平板或接种至液体培养基，37振荡培养12-18小时。

 

斜面保存菌种：挑取菌苔划线至新鲜平板，37培养18-24小时。

 

3、培养观察

 

志贺氏菌在麦康凯琼脂上形成无色透明菌落（不发酵乳糖），在XLD琼脂上呈红色菌落（不产HS）。

 

二、志贺氏菌的保存

 

1、短期保存

 

斜面保存：接种至营养琼脂斜面，37培养18小时后封口，4保存（1-3个月）。

 

半固体穿刺保存：穿刺接种半固体琼脂（含0.5%琼脂），37培养后4保存（3-6个月）。

 

2、长期保存

 

甘油冷冻保存：

 

取对数生长期菌液与无菌甘油（终浓度15%-30%）混合，分装至冻存管，-80保存（2-5年）。

 

冻干保存：菌悬液与保护剂（如脱脂牛奶）混合，冻干后密封，-20或-80保存（5年以上）。

 

三、志贺氏菌的鉴定

 

1、形态学鉴定

 

菌落特征：无色透明（麦康凯）、红色（XLD），边缘整齐，直径约1-2 mm。

 

革兰氏染色：革兰阴性短杆菌，无芽孢、无荚膜、无鞭毛（无动力）。

 

2、生化试验

 

关键生化反应：

 

试验项目 志贺氏菌结果

 

TSI（三糖铁） 斜面红色/底层黄色（产酸不产气，HS阴性）

 

MIU（动力-吲哚-尿素） 动力（-）、吲哚（+/-，因种而异）、尿素（-）

 

氧化酶试验 阴性

 

乳糖发酵 阴性（除宋内志贺氏菌迟缓发酵）

 

3、血清学分型

 

使用志贺氏菌多价及单价抗血清进行玻片凝集试验，分为4个群（A: 痢疾志贺氏菌；B: 福氏志贺氏菌；C: 鲍氏志贺氏菌；D: 宋内志贺氏菌）。

 

4、分子生物学鉴定

 

PCR检测：靶向志贺氏菌毒力基因。

 

16S rRNA测序：比对基因序列确认种属。

 

四、注意事项

 

生物安全：实验废弃物需高压灭菌（121, 30分钟），实验台用70%乙醇或含氯消毒剂处理。

 

交叉污染：严格区分志贺氏菌与大肠杆菌（某些生化反应相似，如宋内志贺氏菌与大肠杆菌O157需通过血清学或分子方法区分）。

 

质量控制：使用标准菌株（如ATCC 25931）作为阳性对照。

 

通过以上步骤可系统完成志贺氏菌的活化、保存及鉴定，确保实验结果的准确性和实验人员的安全。

 

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