血液增菌培养基的条件控制与使用方法及标准化流程！

 

 

血液增菌培养基的使用需遵循“样本采集→增菌培养→分离纯化→后续鉴定”的标准化流程，核心目标是高效富集血液中低浓度致病菌，同时确保操作无菌性、结果可重复性。以下是针对临床检验、科研及食品卫生等场景的详细使用方法，含关键操作步骤、条件控制及实操细节：

 

一、使用前准备

 

1、培养基与耗材准备

 

培养基选择：

 

液体增菌：优先选用商业化血培养瓶，含基础营养、5%~10% 羊血/马血、抗凝剂（SPS）及还原剂（厌氧菌配方含半胱氨酸），按需选择需氧型、厌氧型或双相瓶（液体 + 固体）。

 

固体分离：羊血琼脂平板（SBA）、巧克力琼脂平板（CA）、厌氧血琼脂平板，提前从 4冰箱取出，复温至室温（避免冷凝水影响划线）。

 

耗材与仪器：无菌注射器（10mL）、接种环（镍铬丝/一次性）、移液管（1mL/10mL）、生物安全柜、恒温振荡培养箱（需氧菌）、厌氧培养箱/产气袋（厌氧菌）、自动化血培养仪（临床常用）。

 

培养基质量检查：

 

液体培养基：无浑浊、无沉淀、瓶身无破损，有效期内使用（储存于 2~8，避免阳光直射）。

 

固体培养基：平板表面平整、无裂痕、无杂菌菌落，血液分布均匀（无溶血斑）。

 

2、环境与人员准备

 

操作全程在生物安全柜（二级）内进行，提前紫外线消毒 30 分钟，通风 10 分钟。

 

人员穿戴无菌手套、口罩、防护服，避免交叉污染；接种环、剪刀等金属器具需经酒精灯外焰灭菌（冷却后使用，避免烫伤细菌）。

 

二、核心操作流程（以临床血液样本为例）

 

步骤 1：样本采集与接种（关键无菌步骤）

 

（1）血液样本采集

 

消毒流程：皮肤消毒采用“三步法”——75% 酒精擦拭采血部位→待干 30 秒→碘酊/氯己定涂抹→待干 1 分钟→酒精脱碘（避免碘残留抑制细菌生长）。

 

采血与接种：

 

成人采集 5~10mL 静脉血，儿童 1~3mL（婴幼儿 0.5~1mL），使用无菌注射器直接注入血培养瓶（避免空气过多进入，厌氧菌瓶需排尽空气）。

 

接种后轻轻颠倒血培养瓶 5~10 次，确保血液与培养基充分混匀，同时激活抗凝剂（SPS），防止血液凝固。

 

注意：采集后 2 小时内完成接种，若延迟接种，需将血培养瓶暂存于 2~8（不超过 24 小时），避免细菌死亡或杂菌过度生长。

 

（2）其他样本接种（如食品、动物血液）

 

固体样本：称取 25g 样本，加入 225mL 缓冲蛋白胨水（前增菌），均质后取 10mL 上清液注入血培养瓶；液体样本直接取 5~10mL 注入增菌瓶。

 

步骤 2：液体增菌培养（富集目标菌）

 

（1）培养条件设置

 

培养类型      温度    环境要求    培养时间   振荡条件

 

需氧/兼性厌氧  35±2  有氧环境（培养箱空气流通）  常规 18~24 小时；缓慢生长菌7~14 天  振荡培养（150~200rpm），增加营养接触面积

 

厌氧  35±2  厌氧环境（厌氧产气袋/培养箱，O≤1%）  24~48 小时；苛求菌延长至 72 小时  静态培养（避免氧气进入）

 

微需氧（如幽门螺杆菌）  37  5% O、10% CO、85% N  48~72 小时  轻微振荡（50~100rpm）

 

（2）增菌效果监测

 

肉眼观察（手动监测）：

 

阳性指征：培养基浑浊（细菌增殖）、产气（瓶内压力升高，瓶盖鼓起）、溶血（红色培养基变澄清或呈樱桃红色）、沉淀（细菌聚集于瓶底）、薄膜形成（如结核分枝杆菌）。

 

阴性对照：同时设置空白培养基对照，避免假阳性。

 

步骤 3：分离纯化（获得单菌落）

 

（1）接种时机

 

增菌瓶出现阳性指征（肉眼观察或仪器报警）后，立即进行分离（避免延迟导致杂菌过度生长或目标菌活力下降）。

 

（2）接种方法（平板划线法）

 

生物安全柜内，用无菌移液管抽取增菌液 0.1~0.2mL，滴加至固体血液琼脂平板中央。

 

接种环经酒精灯灭菌，冷却后（接触培养基边缘无气泡），从菌液滴处开始，沿平板边缘做“第一区划线”（约 5~6 条平行线）。

 

接种环再次灭菌冷却，将平板旋转 90°，从第一区划线末端交叉划线至第二区（避免重复划线），同理完成第三、四区划线（每区划线密度逐渐降低）。

 

巧克力平板（用于营养苛求菌）接种后，需置于 5% CO培养箱（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌需 CO促进生长）。

 

（3）培养条件

 

需氧菌：35±2，有氧环境，培养 18~24 小时。

 

厌氧菌：35±2，厌氧环境，培养 24~48 小时。

 

营养苛求菌（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌）：35±2，5% CO，培养 48 小时。

 

步骤 4：后续鉴定与药敏试验

 

（1）菌落观察与初步分类

 

观察单菌落形态：大小、颜色、边缘（光滑/粗糙）、隆起度、溶血特性（α 溶血：草绿色环；β 溶血：透明环；γ 溶血：无溶血）。

 

革兰氏染色：根据染色结果（革兰氏阳性/阴性、球菌/杆菌）初步判断菌属（如革兰氏阳性球菌可能为葡萄球菌、链球菌）。

 

（2）精准鉴定

 

生化试验：使用 API 20E（肠杆菌科）、API Staph（葡萄球菌）等试剂盒，通过代谢产物反应鉴定菌种。

 

质谱分析：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，快速准确鉴定（10 分钟内），适用于临床快速诊断。

 

（3）药敏试验

 

纸片扩散法（K-B 法）：将抗菌药物纸片贴于接种菌液的血液琼脂平板，培养后测量抑菌圈直径，判断敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。

 

微量肉汤稀释法：在 96 孔板中稀释抗菌药物，接种菌液后培养，测定最低抑菌浓度（MIC），指导临床用药剂量。

 

三、不同场景的特殊使用要点

 

1、临床感染检测（败血症/菌血症）

 

样本采集：同一患者需采集 2~3 份不同部位/时间点的血液样本，提高阳性检出率。

 

抗菌药物影响：若患者已使用抗菌药物，选用含树脂或活性炭的血培养瓶（吸附抗菌药物，减少抑制作用）。

 

特殊致病菌：怀疑真菌（如念珠菌）感染，选用真菌专用血培养瓶（添加葡萄糖、胆固醇，延长培养至 7 天）。

 

2、食品卫生检验（如沙门氏菌、李斯特菌）

 

前增菌：食品样本先经缓冲蛋白胨水（BPW）37培养 16~20 小时，再取上清液接种血液增菌培养基（提高菌浓度）。

 

选择性增菌：添加低浓度抑制剂，抑制杂菌，富集目标致病菌。

 

3、科研实验

 

定制培养基：根据实验需求调整营养成分，或使用无血清血液培养基（避免血清成分干扰实验）。

 

定量培养：增菌后采用梯度稀释平板计数法，测定菌落形成单位（CFU/mL），量化细菌增殖效率。

 

四、操作关键注意事项

 

1、无菌控制：

 

所有操作需在生物安全柜内进行，避免皮肤、呼吸道污染样本或操作人员感染（尤其是致病菌如结核分枝杆菌、炭疽芽孢杆菌）。

 

接种环、移液管等耗材需一次性使用或彻底灭菌，避免交叉污染。

 

2、培养条件精准性：

 

温度波动≤±1（温度过高/过低会影响细菌生长速率，如肺炎链球菌在 30以下生长不良）。

 

厌氧培养需确保厌氧环境稳定（产气袋开封后立即使用，培养箱内放置厌氧指示剂）。

 

3、样本处理禁忌：

 

血液样本避免反复冻融（会导致细菌破裂死亡），接种时避免血液体积超过培养基体积的 1/10（过高浓度的血液会抑制细菌生长）。

 

增菌瓶阳性后，若暂时无法分离，需置于 4冷藏（不超过 24 小时），避免细菌过度增殖导致菌落形态异常。

 

4、结果判断误区：

 

液体培养基轻微浑浊可能是血液细胞沉淀，需结合产气、溶血或仪器监测结果确认阳性（避免假阳性报告）。

 

凝固酶阴性葡萄球菌（如表皮葡萄球菌）可能为皮肤污染菌，需结合临床症状和多份样本结果综合判断，避免误判为致病菌。

 

通过以上标准化操作流程，可最大化血液增菌培养基的富集效率，确保低浓度致病菌的有效分离与鉴定，为临床诊断、食品安全检测及科研实验提供可靠支撑。核心原则是无菌操作、精准控制培养条件、针对性选择培养基类型，同时结合后续鉴定技术实现快速准确的结果分析。

 

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