枯草芽孢杆菌原生质体的制备是微生物实验中常用的技术！

 

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）原生质体制备是微生物实验中常用的技术，核心是通过酶解去除细胞壁（主要成分为肽聚糖），获得仅由细胞膜包裹的原生质体，广泛用于细胞融合、转化、噬菌体展示等研究。其制备过程需严格控制菌龄、酶解条件、渗透压等关键因素，具体操作机制与步骤如下：

 

一、制备原理

 

枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁结构以肽聚糖为核心（占细胞壁干重的 90% 以上），无外膜结构。原生质体制备的核心是：

 

抑制细胞壁合成：通过培养基中添加低浓度青霉素（或选择对数生长期后期细菌，此时细胞壁合成活跃且结构较疏松），削弱细胞壁完整性；

 

酶解去除细胞壁：利用溶菌酶（专一性水解肽聚糖的 β-1,4 - 糖苷键）消化细胞壁，释放原生质体；

 

维持渗透压稳定：原生质体无细胞壁保护，需在高渗缓冲液（如含蔗糖、山梨醇的溶液）中操作，避免因渗透吸水破裂。

 

二、关键材料准备

 

1、菌株与培养基

 

菌株：选择对数生长期的枯草芽孢杆菌（菌龄是关键，过老的稳定期细菌细胞壁加厚，酶解难度大；过幼的对数早期细菌易裂解）。

 

培养基：

 

种子培养基（活化菌株）：LB 培养基（胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2）；

 

菌体预处理培养基（诱导细胞壁疏松）：在 LB 中添加0.1-0.5 μg/mL 青霉素（对数生长期中期加入，作用 30-60 分钟，抑制肽聚糖交联），或使用含 2% 甘氨酸的 LB（甘氨酸可替代肽聚糖中的丙氨酸，破坏细胞壁结构）。

 

2、酶与缓冲液

 

酶制剂：溶菌酶（纯度≥80%，活力≥2000 U/mg），使用前用缓冲液配制成1-5 mg/mL 的工作液（浓度需根据菌株耐药性调整，避免酶量过高导致原生质体破裂）。

 

关键缓冲液（均需灭菌，pH 7.0-7.2）：

 

高渗悬浮缓冲液（HSM）：0.5 mol/L 蔗糖 + 20 mmol/L Tris-HCl + 10 mmol/L EDTA（EDTA 可螯合 Ca²、Mg²，辅助破坏细胞壁结构，革兰氏阳性菌可省略 EDTA，但添加后酶解效率更高）；

 

酶解缓冲液：在 HSM 中加入溶菌酶工作液，现配现用；

 

洗涤缓冲液：与 HSM 成分一致，用于酶解后清洗残留酶液。

 

三、详细操作步骤

 

1、菌体活化与培养（获得最佳菌龄）

 

从斜面培养基挑取单菌落，接种至 50 mL LB 液体培养基，37、180-200 rpm 振荡培养 12 小时（活化菌株）；

 

按 1% 接种量将活化菌液转接至新鲜 LB 培养基（或含甘氨酸的预处理培养基），37振荡培养至对数生长期后期（OD=0.6-0.8，此时细菌繁殖活跃，细胞壁易被酶解，可通过分光光度计监测或显微镜观察：菌体呈短杆状，无芽孢形成）；

 

若使用青霉素预处理：在 OD=0.4 时加入青霉素（终浓度 0.1-0.5 μg/mL），继续培养 30 分钟，使细胞壁合成受阻。

 

2、菌体收集与洗涤

 

将培养好的菌液转移至离心管，4、5000 rpm 离心 10 分钟，弃上清（去除培养基成分）；

 

用预冷的高渗悬浮缓冲液（HSM）重悬菌体，轻轻吹打避免菌体破裂，重复离心洗涤 2 次（彻底去除培养基中的低渗成分，防止后续酶解时原生质体吸水）。

 

3、酶解去除细胞壁（核心步骤）

 

用酶解缓冲液（含溶菌酶）重悬菌体，调整菌浓度至 OD=1.0-1.5，转移至锥形瓶；

 

37恒温水浴（或振荡培养箱）酶解，酶解时间为30-60 分钟，期间每隔 10 分钟取样，通过显微镜观察判断酶解效果：

 

未酶解：菌体呈杆状，边缘清晰，革兰氏染色阳性（紫色）；

 

部分酶解：菌体肿胀，边缘模糊；

 

完全酶解：原生质体呈球形，无细胞壁结构，革兰氏染色阴性（红色），且在低渗溶液中（如无菌水）会迅速破裂（可通过“低渗破裂试验”验证：取少量酶解液滴加无菌水，显微镜下观察到球形细胞消失，说明为原生质体）。

 

4、原生质体纯化与保存

 

酶解完成后，4、3000 rpm 低速离心 5 分钟（避免原生质体破裂），弃上清（去除残留溶菌酶）；

 

用预冷的洗涤缓冲液（HSM）重悬沉淀，轻轻吹打，重复离心洗涤 2 次，最终获得纯化的原生质体悬液；

 

原生质体稳定性差，建议现制现用；若需短期保存，可加入 10%-20% 甘油，置于 - 80冷冻保存（解冻后需检测存活率，存活率 =（低渗处理前活菌数 - 低渗处理后活菌数）/ 低渗处理前活菌数 ×100%）。

 

四、关键影响因素与优化策略

 

影响因素     作用机制       优化建议

 

菌龄 对数生长期后期菌体细胞壁疏松，酶解效率高；稳定期菌体形成芽孢或细胞壁加厚 严格控制 OD=0.6-0.8，避免培养过久

 

酶浓度与时间 溶菌酶浓度过低/时间过短：酶解不彻底；浓度过高/时间过长：原生质体破裂 先进行预实验，确定最佳条件

 

渗透压 低渗环境导致原生质体吸水破裂；高渗环境抑制活性 蔗糖浓度控制在 0.5-0.6 mol/L，所有缓冲液需灭菌，避免污染导致渗透压变化

 

温度与 pH 37为溶菌酶最适温度；pH 7.0-7.2 时酶活性最高，过酸/过碱会抑制酶活 恒温水浴严格控温，缓冲液配制后用 HCl/NaOH 调节 pH 至 7.0-7.2

 

预处理剂 青霉素抑制肽聚糖交联，甘氨酸破坏肽聚糖结构，提升酶解效率 革兰氏阳性菌优先用甘氨酸，浓度 0.5%-2%

 

五、常见问题与解决方案

 

酶解后无原生质体形成：

 

原因：菌龄过老（稳定期）、酶浓度过低、pH 不适；

 

解决：重新培养至对数生长期后期，提高酶浓度至 3-5 mg/mL，调整缓冲液 pH 至 7.0。

 

原生质体存活率低（低渗试验破裂少）：

 

原因：酶解时间过长、离心转速过高（＞5000 rpm）；

 

解决：缩短酶解时间至 30-40 分钟，离心转速降至 3000 rpm，操作时轻柔吹打。

 

原生质体聚集沉淀：

 

原因：缓冲液渗透压不稳定、菌体浓度过高；

 

解决：检查蔗糖浓度（补加无菌蔗糖至 0.5 mol/L），稀释原生质体悬液至 OD=0.5-1.0。

 

通过以上步骤，可高效制备高存活率的枯草芽孢杆菌原生质体，为后续的微生物遗传操作（如原生质体融合、外源基因转化）奠定基础。操作中需注意无菌环境，避免杂菌污染导致实验失败。

 

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