大鼠骨髓间充质干细胞之分离、培养及鉴定方法！

 

 

大鼠骨髓间充质干细胞（Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, rBMSCs）是一类存在于骨髓中的多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，广泛应用于组织工程、再生医学和疾病机制研究等领域。以下是关于大鼠BMSCs的详细介绍：

 

一、基本特性

 

1、来源：骨髓腔（股骨、胫骨等长骨）。

 

2、表面标志物：

 

阳性表达：CD90、CD29、CD44、CD105（间充质干细胞标志物）。

 

阴性表达：CD34、CD45（造血干细胞/白细胞标志物）。

 

3、分化能力：

 

成骨细胞（骨组织修复）

 

脂肪细胞（脂肪组织工程）

 

软骨细胞（软骨修复）

 

其他：心肌样细胞、神经样细胞（诱导条件下）。

 

二、分离与培养方法

 

1、分离步骤

 

材料：成年大鼠（通常用SD或Wistar品系）、PBS、低糖DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素/链霉素）。

 

操作流程：

 

处死大鼠，无菌条件下取出股骨和胫骨。

 

冲洗骨髓腔：用注射器将培养基冲入骨髓腔，收集骨髓悬液。

 

离心富集：离心去除血细胞和碎片。

 

接种培养：将细胞接种于含10-15% FBS的DMEM培养基中，37、5% CO培养箱中培养。

 

换液与传代：24-48小时后首次换液去除未贴壁细胞，后续按1:2或1:3比例传代。

 

2、培养条件

 

培养基：低糖DMEM + 10% FBS + 1%双抗。

 

注意事项：

 

原代细胞需差速贴壁法（去除造血细胞）。

 

消化时使用0.25%胰酶（含EDTA），时间控制在2-3分钟。

 

高传代（>P5）可能导致分化能力下降，建议使用P3-P5代细胞。

 

三、鉴定方法

 

1、形态学：长梭形或成纤维细胞样贴壁生长。

 

2、表面标志物检测：流式细胞术验证CD90+/CD29+/CD45-。

 

3、分化能力验证：

 

成骨诱导：培养基含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸，21天后通过茜素红染色（钙结节）鉴定。

 

成脂诱导：培养基含胰岛素、地塞米松、IBMX，14天后油红O染色（脂滴）鉴定。

 

成软骨诱导：微球培养法，阿利辛蓝染色（硫酸软骨素）鉴定。

 

四、应用领域

 

1、骨与软骨修复：用于骨缺损模型（如颅骨缺损）或关节炎研究。

 

2、免疫调节：通过分泌细胞因子抑制炎症反应。

 

3、基因治疗载体：转染特定基因用于血管生成研究。

 

4、疾病模型：研究骨质疏松、糖尿病等代谢性疾病的干细胞功能异常。

 

五、注意事项与常见问题

 

1、污染控制：严格无菌操作，可短期添加双抗。

 

2、细胞纯度：原代中混有造血细胞，需通过换液或流式分选提高纯度。

 

3、分化效率低：优化诱导条件（如血清浓度、生长因子组合）。

 

4、细胞老化：缩短传代间隔，避免过度融合。

 

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