小鼠淋巴结内皮细胞的分离和培养方法及具体操作步骤！

 

小鼠淋巴结内皮细胞的分离和培养是研究其生物学功能的基础，由于淋巴结组织中内皮细胞比例较低（约占细胞总数的 5%-10%），且易受成纤维细胞、免疫细胞等杂细胞污染，需通过特异性分离和纯化步骤获得高纯度细胞。以下是详细的分离与培养方法：

 

一、实验材料准备

 

1、动物与组织

 

通常选用 6-8 周龄的 C57BL/6 小鼠（或根据实验需求选择品系），雌雄均可。

 

取颈部、腋下或腹股沟淋巴结（数量越多越好，单个小鼠可获取 3-5 个淋巴结），避免混杂脂肪和结缔组织。

 

2、试剂与溶液

 

基础培养基：DMEM/F12（1:1）或 EBM-2（内皮细胞专用培养基）。

 

添加剂：胎牛血清（FBS，终浓度 10%）、L - 谷氨酰胺（2 mM）、内皮细胞生长因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50 μg/mL，抑制平滑肌细胞生长）。

 

消化液：0.2% 胶原酶 （或 型，用于解离组织）、0.05% 胰蛋白酶 - EDTA（用于分散细胞团）。

 

其他：PBS（无钙镁）、红细胞裂解液、无菌手术器械（眼科剪、镊子）、培养皿（6 cm 或 12 孔板）、滤网（70 μm 和 40 μm）。

 

3、无菌操作环境

 

超净工作台、CO培养箱（5% CO，37，湿度 95%）。

 

二、分离步骤

 

1、组织收集与预处理

 

颈椎脱臼处死小鼠，75% 酒精浸泡消毒 3-5 分钟。

 

无菌条件下解剖取淋巴结，置于含 PBS（加双抗）的培养皿中，用眼科剪剔除表面脂肪和结缔组织。

 

用 PBS 清洗淋巴结 3 次，去除残留血液和杂质。

 

2、组织解离

 

将淋巴结转移至新的无菌培养皿，用眼科剪剪成 1-2 mm³ 的碎块（越碎越好，便于消化）。

 

加入 5-10 mL 0.2% 胶原酶 溶液，37水浴摇床消化 30-60 分钟（每隔 15 分钟轻轻吹打一次，观察组织块是否分散）。

 

消化结束后，加入等体积含 10% FBS 的培养基终止消化，用 70 μm 滤网过滤，去除未消化的组织碎片，收集滤液。

 

3、细胞分散与纯化

 

滤液 1500 rpm 离心 5 分钟，弃上清，沉淀用 PBS 重悬，再次离心（重复 2 次，去除残留胶原酶）。

 

若细胞中混有红细胞，加入 1 mL 红细胞裂解液，室温静置 5 分钟，PBS 洗涤后离心。

 

用含添加剂的完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，调整细胞密度至 1×10 cells/mL。

 

三、原代培养与纯化

 

1、接种与初期培养

 

将细胞悬液接种至预包被明胶（0.1%）或纤维连接蛋白的培养皿 / 孔板中（包被可促进内皮细胞贴壁）。

 

37、5% CO培养箱中培养，24 小时后更换培养基，去除未贴壁细胞（主要是免疫细胞等）。

 

2、杂细胞去除与纯化

 

差速贴壁法：成纤维细胞贴壁速度快于内皮细胞，可在接种后 2-4 小时轻轻吸出培养液，转移至新培养皿，保留未贴壁的内皮细胞（重复 1-2 次，减少成纤维细胞污染）。

 

选择性培养基：使用含肝素和 ECGF 的内皮细胞专用培养基，抑制成纤维细胞和平滑肌细胞生长，促进内皮细胞增殖。

 

免疫磁珠分选（可选，提高纯度）：

 

用抗 CD31（内皮细胞特异性标记）抗体标记细胞，结合磁珠后通过磁分选柱，收集 CD31细胞，纯度可达 90% 以上。

 

3、传代培养

 

当细胞融合度达到 70%-80% 时进行传代：

 

弃培养基，PBS 清洗 2 次，加入 0.05% 胰蛋白酶 - EDTA，37孵育 2-3 分钟，镜下观察细胞变圆、间隙增大。

 

加入含 FBS 的培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心后重悬，按 1:2 或 1:3 比例接种至新培养皿。

 

注意：原代内皮细胞传代次数有限（通常不超过 5-6 代），超过后易发生表型改变，建议早期冻存备用。

 

四、细胞鉴定方法

 

1、形态学观察

 

内皮细胞呈典型的“铺路石样”形态（多边形或短梭形，排列紧密），与成纤维细胞的长梭形形态有明显区别。

 

2、免疫荧光染色

 

检测特异性标记：PECAM-1，通用内皮标记、窦状内皮细胞、高内皮微静脉 HEVs。

 

阳性细胞比例＞90% 视为纯度合格。

 

3、功能验证

 

血管形成实验：将细胞接种至 Matrigel 基质胶上，观察是否形成管状结构（内皮细胞特征性功能）。

 

五、注意事项

 

无菌操作：淋巴结组织易受污染，全程严格无菌，避免组织暴露时间过长。

 

消化条件：胶原酶消化时间需根据组织块大小调整，过度消化会损伤细胞。

 

纯化关键：差速贴壁和选择性培养基结合可有效减少杂细胞，若需高纯度，建议联用免疫磁珠分选。

 

培养环境：保持 CO浓度稳定，培养基 pH 偏酸性（7.2-7.4），定期更换培养基（2-3 天一次）。

 

通过以上步骤，可成功分离并培养出高纯度的小鼠淋巴结内皮细胞，为研究其在免疫调节、肿瘤转移等领域的功能提供可靠的细胞模型。

 

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