实验室常见的基于分子生物学检测方法分类及详细介绍！

 

百欧博伟生物：基于分子生物学的检测方法是利用核酸（DNA 或 RNA）的特性，通过分析基因序列、结构或表达水平来实现检测目的的技术，广泛应用于微生物鉴定、疾病诊断、基因分型等领域。以下是常见的基于分子生物学的检测方法分类及详细介绍：

 

一、核酸扩增技术

 

通过体外大量扩增目标核酸片段，提高检测灵敏度，是分子生物学检测中最核心的技术之一。

 

1、聚合酶链反应（PCR）

 

原理：在 DNA 聚合酶催化下，以目的基因两端的特异性引物为起点，通过变性（DNA 解链）、退火（引物结合）、延伸（合成子链）三个步骤循环，实现目标 DNA 的指数级扩增。

 

应用：检测特定基因（如葡萄球菌表面抗原的编码基因）、微生物鉴定、基因突变分析等。

 

特点：灵敏度高（可检测单拷贝基因），但扩增产物需通过电泳等方式验证，易受污染导致假阳性。

 

2、实时荧光定量 PCR（qPCR）

 

原理：在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过检测每次循环的荧光强度，实时监测扩增产物的积累，实现定量分析。

 

应用：基因表达量分析、病原体定量检测、拷贝数变异研究等。

 

特点：无需后续电泳，可实时定量，特异性和灵敏度优于常规 PCR。

 

3、多重 PCR

 

原理：在同一反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增多个目标 DNA 片段，通过片段大小差异区分不同靶标。

 

应用：多基因同时检测（如细菌毒力基因、耐药基因组合检测）、基因分型等。

 

特点：高效快捷，节省样本和试剂，但引物设计需避免交叉干扰。

 

4、巢式 PCR

 

原理：分两轮 PCR 扩增，第一轮用外侧引物扩增获得较大片段，第二轮以第一轮产物为模板，用内侧引物扩增更特异的片段。

 

应用：检测低丰度或复杂背景中的目标基因。

 

特点：特异性和灵敏度极高，降低非特异性扩增风险。

 

5、逆转录 PCR（RT-PCR）

 

原理：先以 RNA 为模板，通过逆转录酶合成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，用于检测 RNA（如 mRNA、病毒 RNA）。

 

应用：基因表达分析（检测 mRNA 水平）、RNA 病毒（如流感病毒、新冠病毒）检测等。

 

衍生技术：实时荧光定量 RT-PCR，可定量分析 RNA 含量。

 

二、核酸杂交技术

 

利用核酸分子的碱基互补配对原则，通过标记的探针与目标核酸结合，实现特异性检测。

 

1、Southern 印迹杂交

 

原理：将经电泳分离的 DNA 片段转移至膜上，与标记的 DNA 探针杂交，通过显影检测目标 DNA。

 

应用：基因定位、DNA 片段鉴定、限制性片段长度多态性（RFLP）分析等。

 

2、Northern 印迹杂交

 

原理：与 Southern 印迹类似，但检测对象为 RNA，用于分析特定 RNA 的大小和表达量。

 

应用：mRNA 表达水平检测、RNA 结构分析等。

 

3、原位杂交（ISH）

 

原理：将标记的探针直接与细胞或组织中的核酸（DNA 或 RNA）杂交，通过显微镜观察杂交信号的位置和强度。

 

应用：病原体在组织中的定位、基因在细胞内的表达定位等。

 

衍生技术：荧光原位杂交（FISH），用荧光标记探针，分辨率更高，可用于染色体异常检测（如染色体易位）。

 

4、斑点杂交 / 狭缝杂交

 

原理：将核酸样本直接点样到膜上，与探针杂交，快速检测样本中是否存在目标核酸。

 

应用：批量样本的初筛（如病原体感染快速筛查）。

 

三、基因测序技术

 

直接测定核酸的碱基序列，是分析基因结构和变异的“金标准”。

 

1、Sanger 测序（链终止法）

 

原理：在 DNA 合成反应中加入双脱氧核苷酸（ddNTP）终止链延伸，通过电泳分离不同长度的片段，读取碱基序列。

 

应用：单基因测序、基因突变检测、质粒测序等。

 

特点：准确率高（>99.99%），但通量低，适用于小片段测序。

 

2、下一代测序（NGS，高通量测序）

 

原理：通过大规模并行测序技术，同时对百万至数十亿条 DNA 片段进行测序，快速获得海量序列数据。

 

应用：全基因组测序（WGS）、宏基因组分析（如肠道菌群多样性）、转录组测序（RNA-seq）、外显子测序等。

 

特点：高通量、低成本，可检测未知基因或复杂变异，但数据分析复杂。

 

四、核酸指纹图谱技术

 

通过分析基因组的多态性，生成特异性“指纹”，用于菌株分型、亲缘关系分析等。

 

1、限制性片段长度多态性（RFLP）

 

原理：用限制性内切酶切割基因组 DNA，通过电泳分离片段，结合杂交技术分析片段长度差异，反映基因多态性。

 

应用：细菌分型、亲子鉴定等，但操作较繁琐，已逐渐被其他技术替代。

 

2、随机扩增多态性 DNA（RAPD）

 

原理：用随机引物（通常 10 个碱基）扩增基因组 DNA，通过扩增产物的多态性区分不同样本。

 

应用：菌株快速分型、物种亲缘关系分析，成本低但重复性较差。

 

3、扩增片段长度多态性（AFLP）

 

原理：结合限制性酶切和 PCR 扩增，对酶切后的 DNA 片段加上接头，再用特异性引物扩增，通过片段多态性分析样本差异。

 

应用：高精度分型（如细菌、植物品种鉴定），但操作复杂。

 

4、多位点序列分型（MLST）

 

原理：对多个管家基因（如 7-10 个）的内部片段进行测序，通过序列变异确定等位基因编号，组合成序列型（ST 型），用于菌株分型。

 

应用：细菌种群结构分析、流行病学调查，结果可标准化且易比较。

 

五、其他分子生物学检测技术

 

1、基因芯片（DNA 微阵列）：

 

将大量探针固定在芯片上，与荧光标记的样本核酸杂交，通过检测荧光信号强度，同时分析数千至数万个基因的表达或变异。应用于基因表达谱分析、病原体高通量检测等。

 

2、环介导等温扩增（LAMP）：

 

在等温条件下（60-65），通过特殊引物和 DNA 聚合酶快速扩增目标 DNA，产物可通过浊度或荧光检测。特点是快速、无需热循环仪，适用于现场检测（如基层医疗机构或野外）。

 

3、核酸恒温扩增技术：

 

针对 RNA 的等温扩增技术，无需逆转录和 PCR 的温度循环，适用于 RNA 病毒的快速检测。

 

六、总结

 

基于分子生物学的检测方法具有特异性强、灵敏度高、可定量等优势，选择时需根据检测目标（DNA/RNA、已知 / 未知序列）、样本类型、通量需求及实验条件综合考虑：

 

快速筛查或定量：优先选择 qPCR、LAMP；

 

基因序列分析或未知变异检测：依赖 Sanger 测序或 NGS；

 

菌株分型或流行病学调查：常用 MLST、RAPD 等指纹图谱技术；

 

原位定位：选择 FISH 或原位杂交。

 

这些技术的不断发展和融合，极大地推动了生命科学研究和临床诊断的进步。

 

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