原代内膜细胞培养体系的分离、纯化、培养与鉴定！

百欧博伟生物：原代内膜细胞培养体系是模拟体内生理环境，从新鲜组织中分离、纯化并维持内膜细胞存活与功能的一套完整技术方案，核心在于无菌操作与细胞微环境模拟。

不同来源的内膜细胞（如血管内皮细胞、子宫内膜细胞）培养体系存在差异，但整体框架一致，以下以最常见的血管内皮细胞为例，详细拆解培养体系的核心组成与操作要点。

关键操作步骤（以血管内皮细胞为例）

原代培养流程需严格遵循“分离→纯化→培养→鉴定”的顺序，每一步直接影响细胞活性与纯度。

1、组织样本处理（分离阶段）

样本来源：常用大鼠 / 小鼠主动脉、人脐带静脉（需伦理审批）。

操作步骤：

样本取出后立即用含抗生素的 PBS 冲洗 3 次，去除血液与杂质；

用手术剪剪开血管，内皮面朝上，用无菌棉签轻轻刮取内皮组织（避免刮取中膜平滑肌细胞）；

将刮取的组织块放入含 0.1% 胶原酶的培养基中，37消化 30-60 分钟（根据组织硬度调整）。

2、细胞纯化（关键步骤）

原代培养易混杂成纤维细胞、平滑肌细胞，需通过 2 种方式纯化：

差速贴壁法：内皮细胞贴壁速度慢（2-4 小时），成纤维细胞贴壁快（30 分钟内）。将消化后的细胞悬液接种到培养皿，30 分钟后收集上清液（含未贴壁的内皮细胞），转移至新包被的培养皿中。

免疫磁珠分选法：用内皮细胞特异性抗体标记磁珠，与细胞悬液孵育后，通过磁场分离出阳性内皮细胞（纯度可达 95% 以上）。

3、原代培养与传代

接种培养：将纯化后的细胞以 1×10个 /cm² 的密度接种到预包被的培养皿，加入完全培养基（含 FBS 与生长因子），放入 CO培养箱，每 2-3 天更换一次培养基。

传代时机：当细胞融合度达到 70%-80% 时进行传代（避免过度融合导致细胞分化）。

传代操作：

用 PBS 冲洗细胞 2 次，去除残留培养基；

加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA，37孵育 1-2 分钟，显微镜下观察到细胞变圆后，加入含 FBS 的培养基终止消化；

轻轻吹打细胞制成悬液，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬，按 1:2 比例接种到新培养皿。

4、细胞鉴定（确保纯度）

需通过形态学与分子标志物双重鉴定，确认培养的是目标内膜细胞：

形态学鉴定：倒置显微镜下观察，内皮细胞呈“铺路石样”排列（典型特征），成纤维细胞呈梭形，可通过形态排除杂细胞。

分子标志物鉴定：

免疫荧光染色：检测内皮特异性蛋白，如 CD31（血小板内皮细胞黏附分子）、vWF（血管性血友病因子），阳性率需≥90%；

功能鉴定：进行“管腔形成实验”，内皮细胞在基质上可形成管状结构（成纤维细胞无此功能）。

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