甘油菌种复苏与保存的操作指南及重要注意事项！

 

百欧博伟生物：甘油菌种是微生物实验室常用的长期保存方式（通常在-80）。复苏和保存都需要谨慎操作以保证菌株活性和纯度。以下是详细的步骤和重要的注意事项：

 

一、甘油菌种复苏步骤 (从-80冻存管恢复到活菌)

 

1、准备工作（关键！）：

 

超净工作台/生物安全柜：开启并运行至少15-20分钟，进行紫外灭菌（如有）和空气净化。所有操作必须在无菌环境下进行！

 

个人防护：佩戴实验服、手套（必要时戴护目镜）。处理致病菌时，严格遵守相应生物安全等级的防护要求。

 

实验用品：

 

从冰箱取出待复苏的甘油菌种冻存管 (1.5ml或2ml离心管)。

 

预热的液体培养基 (如LB肉汤等，根据菌种要求选择)。

 

无菌枪头 (200μl, 1000μl)。

 

移液器。

 

恒温水浴锅 (设定为37或其他适宜该菌种的温度)。

 

标记好的培养瓶/管 (用于复苏后培养)。

 

酒精灯（可选，用于灼烧管口）。

 

75%酒精棉球/喷雾。

 

计时器。

 

冰盒（如果一次复苏多管，用于暂存已取出的冻存管）。

 

生物危害废弃物桶。

 

2、取出与快速解冻：

 

从-80冰箱中迅速取出目标冻存管。尽量减少冻存管在室温下的暴露时间。

 

立即将冻存管放入预热好的37水浴锅中。水平握住管子上部，轻轻但快速地来回摇动，使内容物在1-2分钟内完全融化。绝对避免在室温下缓慢融化或在高温水浴中长时间放置！快速融化是为了减少冰晶对细胞的损伤。

 

3、无菌转移：

 

将融化的冻存管立即转移到超净台内。

 

用75%酒精棉球彻底擦拭冻存管外壁进行消毒。

 

打开管盖前，用火焰（酒精灯）快速过一下管口边缘（可选但推荐，尤其对保存时间较长的菌种）。

 

使用无菌移液枪和枪头，吸取50-100μl融化的菌液 (通常管内是0.5-1ml菌液与甘油的混合物)。

 

将吸取的菌液转移到准备好的、装有预热的适量液体培养基（例如5ml LB）的培养瓶或试管中。

 

立即盖好冻存管的盖子，放回冰盒或-80冰箱（如果计划保留原管）。避免反复冻融！

 

4、培养活化：

 

将接种好的培养瓶/管，放入设定好温度（如37）的摇床或培养箱中。

 

根据菌种特性，以适当的转速（通常150-250 rpm）进行振荡培养，或在静置条件下培养。

 

培养时间依据菌种生长速度而定（通常大肠杆菌等需4-6小时，慢生长菌种可能需要过夜或更久）。目标是让菌种恢复活性，进入对数生长期。避免过度培养。

 

5、检查与后续处理：

 

培养后，观察培养基是否变浑浊（指示生长）。

 

根据实验需求：

 

可直接用于后续实验（如质粒提取、蛋白诱导、感受态制备等）。

 

可划线到固体平板上以获得单菌落，进行纯化、鉴定或短期保存。

 

可用于制备新的甘油保存菌种（见第二部分）。

 

二、复苏后菌种的甘油保存步骤（制作新的甘油保存管）

 

1、准备工作：

 

同复苏步骤1（无菌环境、防护、用品）。

 

高压灭菌过的甘油（通常为50%或80%浓度的甘油水溶液）。甘油必须无菌！

 

无菌的冻存管/离心管 (如1.5ml或2ml)。

 

无菌枪头 (200μl, 1000μl)。

 

移液器。

 

标记笔/标签。

 

处于对数生长中期的新鲜菌液（来自复苏后培养物，通常OD600在0.4-0.8之间，细胞活性最好）。

 

75%酒精棉球/喷雾。

 

2、制备菌液-甘油混合物：

 

在超净台内，取适量处于对数生长期的新鲜菌液（液体培养物）加入无菌冻存管中。

 

加入适量无菌甘油，使甘油在混合物中的最终浓度为15-20% (v/v)。这是最常用的浓度范围。

 

例如：加入0.9ml菌液 + 0.1ml 80%甘油 = 1ml混合物，甘油终浓度= (0.1*0.8)/1 = 8% (偏低，不推荐)。

 

正确示例1：0.85ml菌液 + 0.15ml 100%甘油 = 1ml，终浓度15%。

 

正确示例2：0.75ml菌液 + 0.25ml 80%甘油 = 1ml，终浓度= (0.25*0.8)/1 = 20%。

 

正确示例3：0.8ml菌液 + 0.2ml 50%甘油 = 1ml，终浓度= (0.2*0.5)/1 = 10% (偏低，不推荐，易结冰)。

 

计算清楚！确保终浓度在15-20%之间。浓度过低易结冰损伤细胞，过高可能影响菌体代谢。

 

轻柔但充分混匀（可用移液器反复吹打几次，或轻微涡旋）。避免剧烈操作产生气泡或损伤细胞。

 

3、分装与标记：

 

如果一次制备量大，可将混合液分装到多个无菌冻存管中（例如每管0.5-1ml）。避免反复冻融同一管。

 

立即清晰标记冻存管：包括 菌株名称/编号、日期、操作者姓名、甘油浓度（可选）。使用耐低温、防水的标签和记号笔（如冻存管专用笔）。标记在管盖和管身侧面。

 

4、冷冻保存：

 

尽快将标记好的冻存管放入-80冰箱保存。

 

推荐采用梯度降温法（最优）：先将冻存管放入-20冰箱 1-2小时，然后再转移到-80冰箱。这有助于减少冰晶形成对细胞的损伤。

 

次优但常用方法：将冻存管直接放入装有异丙醇的程序降温盒中（盒内异丙醇需足够量），再将整个盒子放入-80冰箱过夜。这种盒子可以提供大约1/min的降温速率。

 

最不推荐（应急可用）：直接将冻存管放入-80冰箱。这是热冲击，对细胞损伤最大，应尽量避免。

 

三、重要注意事项

 

1、通用注意事项

 

无菌！无菌！无菌！这是所有操作的核心。任何污染都会导致菌种报废。确保工作台洁净、操作规范、所有接触菌液的物品无菌。

 

快速操作：无论是复苏时的解冻还是保存时的分装冷冻，都要迅速，减少菌体在不利条件下的暴露时间。

 

精准标记：清晰、准确、耐久的标记是避免混淆的关键。应包括菌株信息和日期。

 

避免反复冻融：每一次冻融都会显著降低菌种活力。保存时务必分装，复苏时只取用一次所需量，剩余原管立即放回-80。切勿将复苏过的冻存管再次冻回-80！

 

记录：详细记录复苏、保存的日期、菌株、培养基、操作者等信息。

 

生物安全：严格遵守实验室生物安全规范，特别是处理致病菌或条件致病菌时。在相应等级的生物安全柜中操作，正确处理废弃物。

 

个人防护：始终佩戴手套和实验服，必要时使用护目镜。

 

2、复苏注意事项

 

快速融化是关键：37水浴快速摇动融化（1-2分钟）。绝对禁止室温慢融或高温水浴长时间放置。

 

适量接种：无需将整管菌液都接种到培养基里，吸取少量（50-100μl）即可。保留大部分原液放回-80以防复苏失败。

 

培养基预热：将培养基预热到培养温度（如37），减少对复苏菌的热冲击。

 

使用新鲜培养基：确保培养基质量良好，未污染，营养充分。

 

培养时间控制：复苏后培养以获得活性恢复为目的，避免培养过度进入衰亡期。

 

3、保存注意事项

 

菌液状态：务必使用对数生长中期的新鲜培养物。静止期或衰亡期的细胞抗冻能力差。培养时间不宜过长（一般不超过16-24小时）。

 

甘油浓度：严格保证终浓度15-20% (v/v)。使用无菌甘油，计算准确。浓度过低易结冰损伤，浓度过高可能抑制生长甚至有毒。

 

甘油无菌：甘油溶液必须高压灭菌（常用121, 15-20分钟）。分装灭菌更方便使用。

 

充分混匀：菌液和甘油必须充分混匀，避免局部浓度过高或过低。

 

分装保存：务必分装成小份（如0.5-1ml/管），禁止大体积保存。方便取用，避免反复冻融。

 

梯度降温：强烈推荐使用-20预冻或程序降温盒，最大限度减少冰晶损伤。直接扔-80是下策。

 

稳定保存：将冻存管放入-80冰箱中温度相对稳定的位置（避免靠近门或经常被翻动的地方）。确保冰箱运行正常，有备用电源或温度报警。

 

4、菌种管理

 

定期检查：定期（如每年）复苏关键菌种，检查其活性和特性（如抗性、形态、质粒等），必要时重新划线纯化并制作新的甘油保存管。

 

备份：重要菌株应在不同冰箱或地点保存备份。

 

遵循这些详细的步骤和严格的注意事项，可以最大程度地保证甘油菌种复苏的成功率和长期保存的稳定性。

 

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