细胞培养过程中细胞出现小黑点的原因有哪些？该怎么预防呢？

 

 

百欧博伟生物：在细胞培养过程中，细胞周围出现的小黑点可能是由多种因素引起的，这些现象可能对细胞生长和实验结果产生负面影响。以下是关于小黑点的常见原因、影响及预防措施的总结：

 

一、小黑点的常见原因

 

1、微生物污染

 

细菌污染：微小颗粒可能为革兰氏阳性菌（如球菌）或阴性菌，培养液可能浑浊且pH快速下降（变黄）。

 

真菌/霉菌污染：可能形成菌丝或孢子团块，呈絮状或点状。

 

支原体污染：肉眼不可见，但可能导致细胞状态变差。

 

2、细胞碎片或死亡细胞

 

细胞凋亡或机械损伤（如吹打过度）产生的碎片，在高密度培养时更常见。

 

3、血清沉淀

 

部分胎牛血清（FBS）在低温储存时可能形成磷酸钙或脂蛋白沉淀，呈细小颗粒。

 

4、其他污染物

 

培养器皿或耗材未清洗干净（如残留的洗涤剂、纤维碎屑）。

 

黑胶虫（争议性存在，可能为微生物污染或细胞代谢产物）。

 

二、小黑点对细胞的影响

 

1、微生物污染

 

抑制细胞增殖，导致细胞死亡；污染可能扩散至其他培养物。

 

2、细胞碎片

 

干扰细胞贴壁，影响细胞计数和形态观察。

 

3、血清沉淀

 

可能被误认为污染，干扰实验操作（如流式检测）。

 

三、鉴别方法

 

1、显微镜观察

 

高倍镜（40×或100×）下观察小黑点是否移动（细菌可能游动）。

 

染色（如革兰氏染色）辅助判断是否为微生物。

 

2、培养液变化

 

浑浊、pH显著下降或出现异味提示微生物污染。

 

3、支原体检测

 

使用PCR或专用检测试剂盒。

 

四、预防与处理措施

 

1、预防微生物污染

 

严格无菌操作：在超净台中操作，定期消毒台面和器械。

 

规范操作习惯：避免手部经过开放培养皿上方，减少说话或咳嗽对培养物的影响。

 

定期更换培养液：及时清除代谢废物和碎片。

 

分装试剂：避免反复解冻导致污染风险增加。

 

2、减少细胞碎片

 

轻柔处理细胞：避免过度吹打或离心速度过高。

 

优化传代频率：避免细胞过度生长后大量死亡。

 

离心或过滤：传代时低速离心（如200×g）去除碎片，或使用细胞筛过滤。

 

3、避免血清沉淀

 

选择优质血清：部分品牌血清沉淀较少。

 

正确解冻：4缓慢融化血清，避免反复冻融。

 

过滤处理：若血清沉淀较多，可用0.22μm滤膜过滤后使用。

 

4、其他预防措施

 

彻底清洗器皿：确保无洗涤剂或杂质残留。

 

定期检测支原体：建议每1-2个月进行一次。

 

五、污染后的处理

 

微生物污染：立即丢弃污染细胞，彻底消毒培养箱及实验区域。

 

细胞碎片：换液时轻柔冲洗，或通过离心去除。

 

血清沉淀：不影响细胞生长时可忽略，必要时过滤血清。

 

六、注意事项

 

避免过度依赖抗生素：长期使用可能掩盖污染或诱导耐药菌。

 

血清沉淀≠污染：无需过度处理，但需与微生物污染区分。

 

通过规范操作和定期监测，可有效减少小黑点的出现，保障细胞培养的稳定性和实验结果的可靠性。若频繁出现污染，需系统性排查实验室环境或操作流程中的漏洞。

 

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