布氏乳杆菌的分离方法和鉴定方法及操作流程总结！

 

布氏乳杆菌的分离和鉴定是研究其生物学特性及应用的基础，过程需结合微生物分离培养技术与现代分子生物学方法。以下是具体的分离和鉴定方法：

 

一、分离方法

 

分离的核心是从样品（如青贮饲料、发酵食品、肠道内容物等）中筛选出布氏乳杆菌，排除其他杂菌干扰。

 

1、样品预处理

 

称取一定量样品（如 10g 青贮饲料），加入 90mL 无菌生理盐水或磷酸缓冲液（PBS），充分振荡制成 10¹ 稀释液。

 

采用梯度稀释法（10² 至 10）进一步稀释，减少杂菌浓度，提高目标菌分离效率。

 

2、选择性培养

 

培养基选择：布氏乳杆菌为乳酸菌，可选用MRS 培养基（强化梭菌培养基，含葡萄糖、蛋白胨等营养成分），并添加特定抑制剂（如万古霉素，抑制革兰氏阴性菌）提高选择性。

 

培养条件：因布氏乳杆菌为兼性厌氧，需在厌氧环境（如厌氧培养箱，通入 N:CO:H=80:10:10 混合气体）中培养，温度控制在其最适生长温度（37-48），培养 24-48 小时。

 

3、单菌落纯化

 

培养后，挑取平板上形态典型的菌落（布氏乳杆菌菌落通常为圆形、边缘整齐、乳白色或浅黄色、表面光滑）。

 

采用划线分离法在新鲜 MRS 平板上多次划线，直至获得纯培养物（单菌落形态一致），并通过显微镜观察确认菌体形态均一（革兰氏阳性杆菌）。

 

二、鉴定方法

 

鉴定需从表型特征、生理生化特性及分子水平多维度验证，确保菌株准确性。

 

（一）表型及生理生化鉴定

 

1、形态学观察

 

革兰氏染色：布氏乳杆菌为革兰氏阳性，镜检呈杆状，无芽孢，不运动。

 

菌落特征：在 MRS 平板上的菌落形态（如大小、颜色、边缘等）可作为初步判断依据。

 

2、生理生化特性测定

 

代谢类型：布氏乳杆菌为异型发酵，可通过检测发酵产物（如产生乳酸、乙酸等）确认（可采用高效液相色谱 HPLC 分析）。

 

糖发酵试验：利用 API 50 CH 试剂盒或糖发酵管，检测其对葡萄糖、乳糖、蔗糖等碳水化合物的发酵能力（布氏乳杆菌通常可发酵葡萄糖、麦芽糖，不发酵木糖等）。

 

生长条件验证：测定其在不同温度（如 20、48、55）和 pH（如 pH 4.0、pH 9.6）下的生长能力，符合其兼性厌氧、耐中高温的特性。

 

酶活性检测：如接触酶试验阴性（不产生接触酶），可与其他杆菌区分。

 

（二）分子生物学鉴定

 

分子水平鉴定是确认菌株的金标准，基于基因序列的特异性分析。

 

1、16S rRNA 基因序列分析

 

提取菌株基因组 DNA，利用 16S rRNA 基因通用引物进行 PCR 扩增。

 

对扩增产物测序，将序列与 GenBank 等数据库中已知布氏乳杆菌的 16S rRNA 基因序列进行同源性比对（如相似度≥97%，可初步判定为该种）。

 

2、特异性基因检测

 

针对布氏乳杆菌的特有基因（如编码乳酸脱氢酶的基因 ldh）设计引物，通过 PCR 扩增验证，进一步提高鉴定特异性。

 

3、其他分子分型方法

 

如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机扩增多态性 DNA（RAPD）等，可用于菌株分型，区分不同来源的布氏乳杆菌菌株。

 

三、鉴定流程总结

 

样品预处理→梯度稀释→选择性培养（MRS 培养基，厌氧条件）→单菌落纯化；

 

形态学观察（革兰氏染色、菌落特征）→生理生化试验（糖发酵、代谢产物等）→分子生物学鉴定（16S rRNA 测序、特异性基因检测）。

 

通过以上多步骤验证，可准确分离并鉴定布氏乳杆菌，为其后续研究和应用（如青贮接种剂开发、益生菌筛选）提供可靠依据。

 

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