细胞培养过程中及时发现和处理污染问题的具体方法有哪些？

 

百欧博伟生物：在细胞培养过程中，及时发现和处理污染是维持细胞活性、保证实验可靠性的关键。污染早期往往有隐蔽迹象，需结合肉眼观察、显微镜检查、辅助检测等手段快速识别，并根据污染类型和程度采取针对性措施。以下是具体方法：

 

一、污染的早期发现：多维度监测

 

1、肉眼观察：直观判断培养基变化

 

细菌污染：培养基通常在污染后 24-48 小时内变浑浊（呈云雾状、乳白或黄色），pH 值快速下降（培养基颜色从红色 / 粉色变为黄色），尤其原代细胞或高密度培养时更明显。

 

真菌污染：初期可能在培养基表面或瓶壁出现白色、黄色或黑色的絮状 / 绒毛状菌落，后期扩散后培养基可能浑浊，pH 值变化较慢（可能偏碱变紫）。

 

支原体污染：肉眼无明显变化，培养基清澈，pH 值基本稳定，需通过其他方法检测。

 

交叉污染（其他细胞）：镜下出现与目标细胞形态、大小差异显著的细胞（如上皮细胞中混入成纤维细胞样梭形细胞），且异常细胞增殖迅速。

 

2、显微镜检查：识别污染特征

 

细菌污染：高倍镜（400×）下可见大量快速移动的小点状、杆状或球状颗粒，分布于细胞间隙或培养基中，严重时覆盖细胞表面，导致细胞皱缩、脱落。

 

真菌污染：低倍镜（100×）下可见树枝状菌丝或圆形孢子，菌丝可能缠绕细胞，导致细胞形态异常（如变圆、死亡）。

 

支原体污染：需用 400× 以上高倍镜或荧光染色（如 Hoechst 染色，支原体 DNA 呈亮蓝色小点附着于细胞表面或核周围），细胞可能出现生长缓慢、形态变圆、空泡增多等非特异性变化。

 

病毒污染：通常无明显形态变化，需通过病毒检测试剂盒或细胞病变效应（CPE，如细胞融合、多核体）判断。

 

3、辅助检测：精准确认污染类型

 

支原体检测：常用 PCR 法（特异性引物扩增支原体基因）、荧光染色法或支原体培养法（需专业培养基），建议每 1-2 周对培养细胞进行常规筛查。

 

细菌 / 真菌鉴定：取少量污染培养基接种至血平板（细菌）或沙氏培养基（真菌），37培养 24-48 小时，观察菌落形态并结合生化试验鉴定种类（如葡萄球菌、念珠菌等）。

 

交叉污染检测：通过 STR 基因分型（人类细胞）或物种特异性 PCR（动物细胞，如小鼠、大鼠）确认细胞来源是否纯净。

 

二、污染的处理：分级应对策略

 

1、轻微污染（早期，污染范围＜10%）

 

适用场景：刚发现少量细菌 / 真菌，细胞仍大部分存活且形态基本正常（多见于原代细胞或珍贵细胞系）。

 

处理方法：

 

立即更换培养基，加入高浓度抗生素（比常规高 5-10 倍）：细菌污染用青霉素 + 链霉素（终浓度 500-1000 U/mL），真菌污染用两性霉素 B（终浓度 2.5-5 μg/mL）或制霉菌素，连续处理 2-3 天，每天换液。

 

处理后镜检：若污染消失，逐步降低抗生素浓度至常规水平；若污染未控制，立即终止（避免扩散）。

 

2、严重污染（污染范围＞30%）

 

适用场景：培养基严重浑浊，大量污染物覆盖细胞，细胞出现明显死亡或形态崩溃。

 

处理原则：果断丢弃，彻底消毒，避免污染扩散至其他细胞或环境。

 

具体步骤：

 

用 75% 酒精彻底擦拭污染培养瓶 / 皿的外壁，密封后放入生物安全袋，按医疗废物处理（不可随意倾倒废液）。

 

立即用 75% 酒精擦拭超净工作台、移液器及培养箱，污染严重时可用含氯消毒液擦拭培养箱内部，或用紫外灯照射 30 分钟以上。

 

排查同批次培养的其他细胞：若发现多个样本污染，需同步处理，并检测试剂（如培养基、血清）是否存在污染。

 

3、支原体污染

 

支原体难以通过常规抗生素清除，且会持续影响细胞代谢和实验结果，建议直接丢弃污染细胞（尤其是非珍贵细胞系）。

 

若为珍贵细胞，可尝试专用支原体清除试剂，按说明书连续处理 1-2 周，期间定期检测支原体是否清除，确认阴性后再传代培养（但成功率较低，且可能影响细胞活性）。

 

4、交叉污染

 

一旦确认交叉污染（如混入其他细胞），该细胞系已失去实验价值，需彻底丢弃，并追溯污染源（如操作时样本混淆、共用试剂），加强样本标记和分区操作。

 

三、污染后的预防措施

 

1、全面排查污染源：

 

检测同批次使用的培养基、血清、胰酶等试剂（取少量无菌培养，观察是否浑浊），若试剂污染需整批丢弃。

 

检查培养箱、超净工作台是否存在卫生死角（如培养箱水盘滋生霉菌），定期清洁消毒（每周 1 次）。

 

2、强化操作规范：

 

操作人员重新培训无菌操作流程，避免在超净台内同时处理多个样本，接触不同细胞后及时更换手套和消毒台面。

 

珍贵细胞系建议低温冻存备份，一旦污染可复苏备用细胞，减少实验损失。

 

3、定期环境监测：

 

每月对培养环境（超净台、培养箱）进行沉降菌检测（暴露平板培养 48 小时，观察菌落数），确保无菌环境达标。

 

四、总结

 

污染处理的核心原则是：“早发现、早处理、严防控”。轻微污染可尝试挽救，但需权衡细胞活性和实验可靠性；严重污染或支原体 / 交叉污染则应果断丢弃，避免污染扩散。日常培养中，建议每日镜检细胞状态，定期筛查支原体，同时严格执行无菌操作，从源头降低污染风险。

 

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