细胞线粒体分离试剂盒的技术原理与操作要点及应用！

 

百欧博伟生物：以下是关于细胞线粒体分离试剂盒的综合说明，整合了技术原理、产品选择、操作要点及最新科研进展：

 

一、试剂盒核心原理与技术

 

线粒体分离主要基于差速离心法，通过控制离心力分步分离亚细胞结构：

 

细胞破碎：使用机械匀浆或裂解缓冲液破坏细胞膜，保持线粒体完整性。未裂解细胞比例需控制在50%左右，过度破碎会损伤线粒体。

 

分级离心：

 

低速离心（600–2000×g）：去除细胞核、未破碎细胞及碎片；

 

高速离心（6000–15000×g）：沉淀线粒体，纯度要求高时可增加密度梯度离心步骤。

 

悬浮介质：缓冲蔗糖溶液（0.25–0.34 mol/L）或甘露醇维持渗透压和pH，防止细胞器聚集。

 

二、主流试剂盒对比与选型建议

 

以下是常见试剂盒的特点与适用场景：

 

货号     分离原理    特点     适用样本      下游应用

 

3139013  差速离心   含内膜/外膜保护缓冲液 培养细胞   蛋白质组学、功能研究

 

PC205   密度梯度离心 高纯度、保留活性 组织/细胞     酶活性、mtDNA提取

 

GL0235  差速离心   可同步获取胞浆蛋白 贴壁/悬浮细胞 细胞色素C释放检测

 

MP1553  裂解+离心  含线粒体裂解液   组织与细胞通用  WB、SDS-PAGE

 

选型参考：

 

高活性需求（如呼吸链功能）：选密度梯度离心试剂盒；

 

蛋白组学：需兼容裂解液且含蛋白酶抑制剂；

 

基础分离：差速离心试剂盒性价比高。

 

三、关键操作注意事项

 

低温操作：全程4环境，预冷离心机与缓冲液，操作时间≤1小时。

 

破碎程度优化：

 

组织：匀浆5–10次后台盼蓝染色检测，未裂解细胞达50%–60%为宜；

 

培养细胞：选用间隙严密的研杵，避免超声过度。

 

离心参数调整：

 

高得率模式：600×g + 12,000×g；

 

高纯度模式：2,000×g + 6,000×g（牺牲30%得率）。

 

抑制剂使用：PMSF需临用前加入裂解液，防降解。

 

四、常见问题与解决方案

 

线粒体膜损伤：匀浆次数过多或离心力过大；改用密度梯度离心保护结构。

 

胞核污染：低速离心步骤重复2次（如1,000×g × 5 min）。

 

得率低：

 

组织：增加预剪碎步骤，控制匀浆体积（组织压积:缓冲液=1:6）；

 

细胞：胰酶消化后充分PBS清洗，防残留酶损伤。

 

活性验证：詹纳斯绿B染色镜检，完整线粒体呈蓝绿色棒状。

 

五、前沿技术动态

 

2016年《Nature》揭示线粒体分裂新机制：Drp1蛋白负责初始收缩，Dyn2蛋白完成最终分裂，修正了传统理论。此发现对研究癌症、代谢疾病中线粒体异常具有意义。

 

六、总结

 

选择试剂盒需结合样本类型（组织/细胞）与下游应用（功能/蛋白/DNA分析）。操作中严格控制温度、破碎度及离心参数，高纯度需求优先密度梯度法。建议参考厂商方案优化条件，并结合前沿机制深化研究设计。

 

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