微生物实验时平板接种菌之后没有菌落生长怎么办？

 

百欧博伟生物：在微生物实验中，平板接种后未观察到菌落生长是常见问题，可能由操作失误、材料问题或环境条件不当等多种原因导致。以下从可能原因、排查方法和解决措施三方面进行详细分析，帮助逐步定位问题：

 

一、接种物（菌种）相关问题

 

接种物是菌落生长的基础，若菌种本身存在问题，会直接导致无菌落。

 

1、菌种失活

 

可能原因：菌种保存不当（如冷冻温度过高、反复冻融、斜面菌种老化超过保质期）、传代过程中污染杂菌导致目标菌被抑制。

 

排查方法：

 

检查菌种保存记录，确认是否在有效期内（如斜面菌种通常 4保存不超过 1 个月，-80冷冻保存需加保护剂）。

 

取原始储备菌种重新接种，观察是否生长（排除传代过程中失活的可能）。

 

解决措施：

 

规范菌种保存：短期用斜面 4保存，长期用甘油管 - 80冷冻（甘油终浓度 15%-20%），避免反复冻融。

 

定期传代（如每月 1 次），确保菌种活性。

 

2、接种量不足或未接种成功

 

可能原因：接种环 / 针未蘸取到菌种（如液体菌种浓度过低、固体菌种挑取时未刮到菌体）、接种时菌液滴落或操作失误导致未转移到平板。

 

排查方法：

 

观察接种工具：接种环蘸取液体菌种后应有明显浑浊液滴，挑取固体菌种后可见少量菌苔。

 

重新接种时增加接种量（如液体菌种取 0.1-0.2mL 涂布，固体菌种多挑取一点菌苔）。

 

解决措施：

 

液体菌种可先测 OD 值（如大肠杆菌 OD600≈0.5 时浓度约 10^8 CFU/mL），确保浓度合适。

 

接种时动作规范：涂布法需将菌液均匀涂满平板表面，划线法确保每一区都与上一区交叉以获得单菌落。

 

二、培养基相关问题

 

培养基是微生物生长的营养来源，若培养基制备或处理不当，会抑制菌落生长。

 

1、培养基灭菌不彻底或被污染

 

可能原因：高压蒸汽灭菌参数错误（如压力不足、时间不够）、灭菌后未及时使用导致二次污染（如平板开盖暴露时间过长）。

 

排查方法：

 

检查灭菌记录：确认灭菌温度（121）、压力（0.1MPa）、时间（15-30 分钟，根据培养基体积调整）是否符合标准。

 

观察空白平板：将未接种的同批次平板同条件培养，若出现杂菌，说明培养基灭菌失败或污染。

 

解决措施：

 

严格灭菌操作：灭菌前检查灭菌器压力表、温度传感器是否正常，灭菌后待压力降至 0 再开盖。

 

平板制备后及时使用，暂存需倒置 4保存，避免超过 1 周。

 

2、培养基成分或 pH 不合适

 

可能原因：配方错误（如漏加关键营养成分，如氨基酸、生长因子）、pH 偏离目标菌适宜范围（如细菌通常 pH 7.0-7.4，真菌 pH 5.0-6.0）、添加了抑制剂（如抗生素对敏感菌的抑制）。

 

排查方法：

 

核对培养基配方：确认是否按比例添加成分（如 LB 培养基需胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl）。

 

检测 pH：用 pH 计测量未灭菌的培养基，或观察培养基颜色（如含酚红的培养基，酸性呈黄色，碱性呈红色）。

 

确认是否误加抑制剂（如筛选抗性菌时加了抗生素，但目标菌无抗性）。

 

解决措施：

 

严格按照配方称量，灭菌前调整 pH 至适宜范围。

 

若需添加敏感成分（如抗生素、维生素），待培养基冷却至 50-60时再加入（避免高温破坏）。

 

3、培养基凝固不良

 

可能原因：琼脂添加量不足（通常 1.5%-2%）、灭菌时温度过高导致琼脂分解、倒平板时温度过低导致凝固不均。

 

排查方法：观察平板是否凝固（倾斜平板无流动），触摸是否有弹性。

 

解决措施：按配方添加琼脂，灭菌时间不超过 30 分钟（避免琼脂降解），倒平板时待培养基冷却至 50-60（手感微烫但不烫手）。

 

三、培养条件相关问题

 

即使接种物和培养基正常，培养环境不适也会导致无菌落。

 

1、温度不当

 

可能原因：培养温度偏离目标菌最适温度（如大肠杆菌 37，乳酸菌 30，真菌 28）。

 

排查方法：检查培养箱温度显示，用温度计校准实际温度（避免培养箱故障导致温度偏差）。

 

解决措施：根据菌种特性设置温度（如嗜热菌需 45-55，嗜冷菌需 10-15），定期校准培养箱。

 

2、气体环境错误

 

可能原因：需氧菌在厌氧环境中培养（如大肠杆菌需有氧）、厌氧菌在有氧环境中培养（如破伤风梭菌需厌氧）。

 

排查方法：

 

确认菌种呼吸类型：需氧菌可在普通培养箱生长，厌氧菌需厌氧罐（加厌氧袋）或厌氧工作站。

 

检查厌氧环境是否有效：厌氧袋是否产气（如美蓝指示剂厌氧条件下呈白色，有氧呈蓝色）。

 

解决措施：

 

需氧菌：普通培养箱（静置或摇床震荡增加溶氧）。

 

厌氧菌：使用厌氧罐，加入厌氧产气袋（如含亚硫酸钠的袋子），并密封确保无氧。

 

3、培养时间不足

 

可能原因：部分生长缓慢的菌种（如分枝杆菌、真菌）需要更长时间（细菌通常 1-2 天，真菌 3-7 天，分枝杆菌需 2-4 周）。

 

排查方法：延长培养时间（如细菌培养 48 小时，真菌培养 7 天）后观察。

 

解决措施：根据菌种特性设置培养时间，生长缓慢的菌种需标记并延长培养。

 

四、操作过程污染或干扰

 

操作不规范可能引入抑制剂或导致杂菌竞争，抑制目标菌生长。

 

1、接种工具灭菌不当

 

可能原因：接种环 / 针灭菌不彻底（如灼烧后未冷却，烫死菌种；或灭菌后触碰污染物）。

 

排查方法：观察接种环灼烧后是否完全红热（确保灭菌），冷却时是否接触桌面或其他物品。

 

解决措施：

 

接种环灭菌：灼烧至红热后，在无菌琼脂边缘冷却 3-5 秒（避免烫死菌种）。

 

灭菌后避免触碰任何非无菌表面。

 

2、杂菌污染抑制目标菌

 

可能原因：操作环境（超净台）污染、手或实验服污染，导致杂菌大量繁殖并抑制目标菌。

 

排查方法：观察平板是否有异常菌落（如颜色、形态与目标菌不同），或空白平板是否污染。

 

解决措施：

 

操作前紫外消毒超净台 30 分钟，用 75% 酒精擦拭台面和双手。

 

接种时避免说话、咳嗽，减少空气流动干扰。

 

五、系统排查建议

 

若以上单一原因未找到问题，可按以下步骤系统排查：

 

对照实验：用已知活性的标准菌种（如实验室保存的大肠杆菌 ATCC 25922）接种同批次平板，同条件培养。若标准菌种生长，说明问题在原始菌种；若不生长，说明问题在培养基或培养条件。

 

重复操作：严格按照标准流程重新接种（更换菌种、培养基、培养条件），排除偶然操作失误。

 

分步验证：分别验证“菌种活性”（接种液体培养基观察浑浊度）、“培养基有效性”（接种标准菌）、“培养条件”（用温度计和厌氧指示剂确认）。

 

通过以上排查，通常能找到无菌落生长的原因。关键是规范操作流程，做好实验记录（如菌种来源、培养基配方、培养条件等），以便快速定位问题。

 

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