实验室控制微生物平板菌落蔓延的操作方法与预防措施！

 

百欧博伟生物：控制微生物平板上的菌落蔓延是微生物学实验（如计数、分离纯化、鉴定）中的关键步骤。蔓延的菌落会干扰计数准确性、掩盖目标菌落、导致交叉污染，甚至使整个平板失效。以下是一些有效的方法和策略：

 

一、基础预防措施（针对常见原因）

 

1、优化培养基成分与制备：

 

确保足够的琼脂浓度：使用标准配方（通常1.5%-2.0%琼脂）。琼脂浓度过低是导致蔓延的主要原因之一。对于特别容易蔓延的菌（如某些芽孢杆菌、变形杆菌、假单胞菌），可适当增加琼脂浓度（如2.2%），但需注意过高的浓度可能抑制某些菌生长或影响菌落形态观察。

 

彻底干燥平板：这是极其重要的一步！

 

倒平板后充分干燥：将凝固的平板在超净工作台或培养箱中（盖子微开，防止污染）放置一段时间（30分钟至数小时，甚至过夜），让表面多余的水分蒸发掉。表面应看起来“哑光”而非“水亮”。

 

使用预干燥平板：提前一天或数天制备好平板，倒置储存于冰箱或室温，使用前在温箱中平衡温度并确保表面干燥。

 

控制倾注温度：将融化的琼脂冷却至约45-50（手感温热但不烫）再倾注。温度过高会产生更多冷凝水；温度过低则琼脂易凝固结块。

 

避免过度晃动：倾注后轻轻旋转平板使培养基均匀铺开即可，避免剧烈晃动产生气泡或导致表面不平整。

 

2、优化接种技术：

 

划线分离：这是分离单个菌落的标准方法。确保：

 

接种环/针灭菌彻底。

 

第一区划线密集以获得足够菌量，后续各区依次稀释。

 

每划完一个区，烧灼接种环冷却后再划下一区。

 

最后1-2区采用“不重叠”的单方向划线（如放射状、平行线），减少菌体被推挤移动的机会。

 

避免划破琼脂表面。

 

涂布法：

 

使用无菌玻璃涂布棒或一次性塑料涂布棒。

 

确保样品液滴被琼脂完全吸收（稍等片刻）后再涂布。

 

动作轻柔、快速、覆盖均匀，避免用力过猛导致菌液飞溅或渗入琼脂深层。涂布棒不要过度施压。

 

涂布后稍等片刻，待液体吸收再倒置培养。

 

倾注法：

 

将样品与融化并冷却至约45的琼脂充分混匀。

 

倒入培养皿后，立即水平旋转混匀，然后静置凝固。

 

凝固后充分干燥表面。

 

点种/穿刺：对于特定的鉴定或保藏，直接将少量菌点种在表面或穿刺到半固体深层，通常不易蔓延。

 

3、控制培养条件：

 

避免过度潮湿：培养箱内湿度过高会增加平板内冷凝水。可在培养箱内放置干燥剂。

 

倒置培养：至关重要！将平板倒置（盖在下，基在上）培养。重力作用使冷凝水聚集在盖子上，不会滴落到琼脂表面冲散菌落。这是防止因冷凝水导致蔓延的最有效方法之一。

 

缩短培养时间：在达到足够菌落数量和大小后，及时观察和计数。某些快速生长的蔓延菌（如变形杆菌）可能在24小时后就开始明显扩散。对于计数平板，通常48小时是上限。

 

控制温度：在目标菌最适温度下培养，避免过高温度加速某些菌的游动/滑动生长。

 

二、特殊控制方法（针对顽固性蔓延或特定需求）

 

1、添加表面活性剂/抑制剂（谨慎使用）：

 

原理：降低琼脂表面张力，抑制菌体的游动或滑动能力。

 

常用试剂：

 

聚山梨酯80：常用浓度0.001%-0.1%。效果较温和，对多数菌生长抑制较小。

 

Triton X-100：常用浓度0.001%-0.1%。效果可能更强，但也可能对某些菌有更强抑制。

 

苯酚：浓度非常低。效果显著，但毒性较大，可能抑制目标菌生长，需严格测试。

 

注意事项：

 

这些物质可能影响目标微生物的生长速度、菌落形态、代谢活性或后续鉴定（如溶血性、色素产生）。

 

必须进行预实验，验证对目标菌的最小抑制浓度和影响程度。

 

不适合所有类型的实验（如抗生素敏感性试验、某些生化反应）。

 

2、使用表面干燥剂：

 

原理：在培养过程中持续吸收平板内的湿气。

 

方法：

 

在培养皿盖内侧（或平板边缘）放置一小块无菌干燥剂（如硅胶颗粒、无水氯化钙颗粒，用无菌滤纸包好）。

 

或者，在倒置培养的平板盖子中央放一小团无菌脱脂棉，也能吸收部分冷凝水。

 

优点：物理方法，不影响微生物生长。

 

缺点：操作稍繁琐，需确保干燥剂无菌且不会掉落到琼脂表面。

 

3、使用特定培养基：

 

高盐培养基：如用于葡萄球菌。高盐浓度能抑制许多革兰氏阴性菌（包括容易蔓延的变形杆菌）的生长。

 

选择性/鉴别性培养基：利用目标菌和污染菌/蔓延菌对不同成分的耐受性或代谢差异。例如：

 

麦康凯琼脂（抑制革兰氏阳性菌）。

 

EMB琼脂（抑制革兰氏阳性菌，鉴别大肠菌群）。

 

XLD琼脂（抑制革兰氏阳性菌，抑制变形杆菌蔓延）。

 

添加特定抑制剂：在基础培养基中加入针对常见蔓延菌的抗生素或其他抑制剂。

 

4、物理隔离法：

 

在琼脂表面划格：用无菌解剖刀或接种环在干燥的琼脂表面轻轻划出方格（不要划穿）。将菌接种在方格中央。蔓延通常被限制在方格内。适用于分离纯化。

 

使用中心凹陷平板：某些特殊设计的平板中央有凹陷，将菌接种在凹陷中心。

 

总结与建议

 

基础是关键：绝大多数情况下，做好培养基充分干燥、倒置培养、优化接种技术这三点，就能有效控制大部分蔓延问题。

 

针对性强：分析你实验中常见的蔓延菌是什么？是冷凝水过多？还是菌本身具有游动性？根据原因选择最合适的方法。

 

循序渐进：优先尝试物理方法和优化操作流程。如需使用化学添加剂（表面活性剂、抑制剂），务必进行预实验评估其影响。

 

结合使用：有时需要多种方法结合使用，例如：使用干燥良好的平板 + 倒置培养 + 添加微量Tween 80。

 

注意安全与规范：使用任何化学添加剂都需了解其安全性和对实验结果可能的影响，并遵守实验室安全规程。

 

通过系统性地应用以上方法，通常可以有效地控制微生物平板上的菌落蔓延，获得清晰、可计数的菌落分布。

 

示例操作流程（以涂布法计数为例）：

 

提前准备：提前1-2天制备平板，倒置存放于4°C冰箱。

 

使用前干燥：使用前1-2小时取出，倒置于温箱中（37°C）或超净台中（盖微开）使表面彻底干燥（无可见水膜/反光）。

 

样品稀释与加样：将适当稀释度的样品（0.1-0.2ml）滴加到平板中央。

 

吸收等待：静置几分钟，待液体被琼脂吸收。

 

无菌涂布：使用无菌涂布棒，动作轻柔、快速、均匀地将液体涂开。

 

吸收等待：再静置片刻（5-15分钟）。

 

倒置培养：将平板倒置放入培养箱。

 

控制时间：在目标培养时间（如24-48小时）及时观察计数。

 

案例：控制金黄色葡萄球菌计数中的变形杆菌蔓延

 

问题：环境样品中变形杆菌蔓延覆盖金黄色葡萄球菌菌落。

 

解决方案：

 

使用高盐选择性培养基：天然抑制大多数变形杆菌。

 

充分干燥平板和倒置培养：进一步减少任何可能的蔓延机会。

 

缩短培养时间：金黄色葡萄球菌在选择性培养基上通常24小时可见明显菌落，及时计数避免变形杆菌后期过度生长。

 

通过选择合适的策略组合，你可以有效克服菌落蔓延的挑战，确保实验结果的可靠性。

 

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