控制菌的检验方法验证有哪些注意事项？该如何操作？

 

百欧博伟生物：控制菌检验方法验证是确保检验结果准确、可靠的关键环节，需结合样品特性、目标菌生物学特征及检验方法的细节，规避潜在误差。以下是核心注意事项：

 

一、样品处理的合理性

 

1、基质干扰的预判与处理

 

需提前分析样品是否含抑菌成分（如防腐剂、抗生素、中药中的抑菌成分），或物理状态是否影响菌的分离（如油脂类、混悬液、高黏度样品）。例如：

 

含酒精的样品需先中和（如加硫代硫酸钠）或稀释至抑菌浓度以下；

 

油膏类样品需用乳化剂（如吐温 80）分散，避免菌被包裹无法生长。

 

若样品本身有杀菌 / 抑菌作用，必须通过预试验确认干扰程度（如回收率＜50% 时，需采用稀释、中和、膜过滤等方法消除干扰，且需验证这些处理措施本身对目标菌无毒性）。

 

2、供试液制备的一致性

 

严格遵循方法规定的稀释倍数、pH 值、温度等参数，确保每次处理的供试液状态一致（如混悬液需混匀后立即取样，避免菌沉降导致浓度不均）。

 

二、目标菌与对照菌的选择

 

1、目标菌的代表性

 

选用标准菌株（如 ATCC、CMCC 菌株），避免使用临床分离株（可能因变异导致特性改变，影响验证结果）。例如：验证大肠杆菌时，需用大肠杆菌，而非其他来源的菌株。

 

确保目标菌处于对数生长期（活力强，易繁殖），菌悬液需新鲜制备（一般制备后 2h 内使用，或 4冷藏不超过 24h），避免因菌老化导致回收率偏低。

 

2、阴性对照菌的针对性

 

阴性对照菌需选择与目标菌形态或生化特性相似的菌株，以验证方法的特异性。例如：

 

验证金黄色葡萄球菌时，用表皮葡萄球菌（同属、形态相似但生化特性不同）；

 

验证沙门菌时，用大肠埃希菌（肠道菌，易混淆）。

 

三、试验设计的规范性

 

1、菌浓度的精准控制

 

加入样品的目标菌浓度需严格控制在10-100 CFU（中国药典等标准要求），过高可能掩盖样品的抑菌作用，过低则可能因随机误差导致结果不稳定。

 

菌悬液的浓度需通过平板计数法校准（而非仅靠比浊法估算），确保实际加入量符合设计要求。

 

2、对照试验的完整性

 

必须同时设置阳性对照（仅目标菌，无样品）、阴性对照（仅样品，无目标菌）和空白对照（仅培养基和试剂）：

 

阳性对照用于确认目标菌在试验条件下可正常生长（排除培养基、培养条件的问题）；

 

阴性对照用于确认样品本身不含目标菌（避免假阳性）；

 

空白对照用于确认试剂、环境无外源污染。

 

3、重复试验的必要性

 

关键项目（如检出限、耐用性）需多次重复（至少 3 次，建议 5 次），避免单次试验的偶然性误差。例如：检出限验证中，需确保 1-5 CFU 的目标菌在多次试验中均能被检出（检出率≥95%）。

 

四、培养基与试剂的质量控制

 

1、选择性培养基的适用性

 

控制菌检验依赖选择性培养基（如大肠杆菌用麦康凯琼脂，金黄色葡萄球菌用甘露醇高盐琼脂），需验证其选择性和促生长能力：

 

促生长：接种目标菌后，菌落形态典型、生长良好；

 

选择性：非目标菌（如阴性对照菌）在该培养基上不生长或生长受抑制。

 

培养基需在有效期内使用，且批次间差异需通过耐用性验证（换用 2-3 批培养基重复试验，结果一致）。

 

2、鉴定试剂的可靠性

 

生化鉴定试剂（如凝固酶试剂、靛基质试剂）需在有效期内，且通过阳性 / 阴性对照验证其有效性（如凝固酶试剂需用金黄色葡萄球菌验证阳性，表皮葡萄球菌验证阴性）。

 

五、培养条件的严格控制

 

1、温度与时间的精准性

 

培养温度需稳定（±1），避免因 incubator（培养箱）温度不均导致结果偏差（如 35培养的目标菌，若实际温度降至 30可能生长缓慢）。

 

培养时间需足够（如沙门菌的增菌培养需 18-24h，不足则可能因菌量不足导致漏检），但也不可过长（可能导致杂菌过度繁殖干扰目标菌）。

 

2、厌氧 / 微需氧条件的特殊性

 

若目标菌为厌氧菌（如破伤风梭菌），需验证厌氧培养装置的有效性（如厌氧袋的厌氧指示剂变色、氧气浓度监测），避免因氧气残留导致菌不生长。

 

六、干扰处理措施的合理性

 

1、中和剂的选择与验证

 

若使用中和剂（如 β- 内酰胺酶中和青霉素，卵磷脂中和季铵盐类防腐剂），需同时验证：

 

中和剂对抑菌成分的中和效果（样品抑菌作用消失）；

 

中和剂本身对目标菌无毒性（单独加入中和剂的阳性对照菌生长良好）。

 

2、膜过滤法的操作细节

 

滤膜孔径需为0.45μm（确保目标菌截留，抑菌成分通过）；

 

过滤时避免供试液过度浓缩（可能残留抑菌成分），必要时用稀释液冲洗滤膜（1-3 次，需验证冲洗不导致目标菌流失）；

 

滤膜转移至培养基时需完全贴合（避免气泡影响菌生长）。

 

七、结果判断的客观性

 

1、形态与生化特征的综合判断

 

不可仅凭菌落形态判断，需结合生化试验（如大肠杆菌需同时满足靛基质阳性、甲基红阳性）和特异性鉴定（如沙门菌的血清学凝集试验），避免假阳性。

 

对“疑似菌落”需进一步确认（如挑取多个菌落重复试验），防止漏检。

 

2、阴性结果的谨慎处理

 

若试验组未检出目标菌，需排除以下可能：

 

样品处理时目标菌被意外杀灭（如温度过高）；

 

培养基失效或培养条件错误；

 

菌悬液浓度实际为 0（需核查阳性对照是否生长）。

 

八、验证过程的记录与追溯

 

1、原始数据的完整性

 

详细记录菌悬液浓度、样品处理步骤、培养条件、菌落计数、生化反应结果等，确保可追溯。

 

保留关键图谱（如菌落形态照片、生化试剂显色结果）。

 

2、方法变更的再验证

 

若样品配方、生产工艺变更（可能引入新抑菌成分），或检验方法参数调整（如培养基种类、培养时间），需重新验证方法适用性。

 

九、总结

 

控制菌检验方法验证的核心是“排除干扰、确保特异性、保证可重复性”，需从样品处理、菌株选择、试验设计到结果判断的全流程严格把控，结合样品特性和目标菌生物学特征，避免因细节疏漏导致假阳性或假阴性结果，最终保证“不得检出”的控制菌结果准确可靠。

 

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