细胞解冻培养过程中，如何判断细胞是否受到污染？

 

百欧博伟生物：在细胞解冻培养过程中，细胞污染的早期识别是避免实验失败、防止污染扩散的关键。污染类型主要包括细菌污染、真菌污染、支原体污染及交叉污染（其他细胞系混入），不同污染类型的判断依据（形态、培养基变化、检测手段）存在差异，需结合“肉眼观察 + 显微镜观察 + 特异性检测”综合判断。

 

一、肉眼观察：快速初步筛查（复苏后 24-72h 重点关注）

 

肉眼观察主要通过培养基外观变化判断，适用于细菌、真菌等“显性污染”，是最直接的初步判断手段。

 

污染类型     培养基肉眼特征    出现时间     关键提示

 

细菌污染  1.浑浊度变化：从清澈透明→轻度浑浊（乳白色、淡黄色）→重度浑浊（不透明，晃动时呈“牛奶状”）；2.颜色变化：部分细菌代谢产酸，导致含酚红的培养基从红色→黄色（pH 下降）；少数产碱细菌可能使培养基变紫（pH 升高）；3.沉淀/膜状物：重度污染时，瓶底或液面可能出现细小白色 / 黄色沉淀（细菌聚集）。  快（24-48h 内）  浑浊速度快，是最易肉眼识别的污染类型

 

真菌污染  1.菌落特征：液面或瓶壁出现白色、黑色、绿色绒毛状/棉絮状菌落；2.浑浊度：早期培养基仍清澈，后期因真菌菌丝扩散，可能轻度浑浊；3.沉淀：真菌孢子或菌丝脱落，瓶底可能出现白色/褐色细小沉淀。 较慢（48-72h，甚至更久） 菌落形态典型，是肉眼判断的核心依据，需注意与细胞团块区分（菌落不随培养基晃动分散）

 

支原体污染  无明显肉眼变化：培养基始终清澈透明，颜色（酚红指示剂）无异常，无沉淀或菌落，肉眼无法直接识别。 无（隐性污染） 需依赖显微镜观察或特异性检测，是最易被忽视的“隐性杀手”

 

交叉污染 无肉眼特征：培养基外观正常，需通过细胞形态或特异性检测判断。 无 肉眼无法识别，需结合显微镜或分子生物学手段

 

二、显微镜观察：精准识别污染形态（核心判断环节）

 

肉眼观察异常后，需通过倒置显微镜（100×-400× 倍率）观察细胞及污染物形态，进一步确认污染类型，同时区分“污染”与“细胞正常现象”。

 

1、细菌污染（100×-200× 倍率即可清晰观察）

 

形态特征：

 

细菌呈短杆状、球状、螺旋状（如大肠杆菌为短杆状，葡萄球菌为球状），大小远小于细胞（通常 0.5-2μm，细胞直径约 10-20μm）；

 

分布位置：游离于培养基中（布朗运动明显，随液体流动），或附着在细胞表面（导致细胞皱缩、脱落）；

 

与细胞凋亡小体区分：凋亡小体大小与细胞接近（1-5μm），无自主运动，且伴随细胞凋亡特征，而细菌运动活跃、数量随时间快速增加。

 

2、真菌污染（200×-400× 倍率观察）

 

形态特征：

 

酵母菌：呈圆形或椭圆形小颗粒（直径 3-5μm），常聚集成团，无菌丝，易与细胞碎片混淆（需观察是否有出芽生殖，酵母菌可通过出芽产生子代，细胞碎片无此特征）；

 

霉菌：可见细长丝状菌丝（直径 2-10μm），菌丝可交织成网状，附着在细胞表面或培养基中，部分菌丝顶端有孢子囊（圆形/椭圆形，是真菌繁殖的关键特征）；

 

与细胞聚团区分：细胞聚团时，细胞形态完整（如贴壁细胞仍有梭形、多边形特征），而真菌菌丝无细胞结构，且会逐渐包裹细胞导致细胞死亡。

 

3、支原体污染（400× 油镜或荧光染色观察）

 

直接观察（难度高）：支原体大小仅 0.2-0.8μm，普通光学显微镜（400×）下难以清晰分辨，需 400× 油镜（需滴加香柏油），观察到细胞表面或培养基中“点状、杆状微小颗粒”（数量多，无明显运动），但易与杂质混淆，需结合其他方法确认。

 

间接细胞形态变化（辅助判断）：支原体附着在细胞表面，掠夺营养并释放毒素，导致细胞出现特征性异常：

 

贴壁细胞：形态变圆、胞质出现空泡、贴壁能力下降（大量漂浮）、增殖速度显著减慢；

 

悬浮细胞：聚团严重、细胞体积缩小、活性降低（台盼蓝染色阳性率升高）。

 

4、交叉污染（200× 倍率观察细胞形态）

 

判断依据：培养体系中出现两种或两种以上形态差异明显的细胞（如原本为梭形的成纤维细胞中，混入圆形的肿瘤细胞），且“异常细胞”数量随传代逐渐增加，挤压正常细胞生长空间；

 

示例：HeLa 细胞（上皮样，多边形）污染 MSC 细胞（间充质样，梭形），显微镜下可见两种形态细胞共存，且 HeLa 增殖更快，最终可能取代 MSC。

 

三、特异性检测：确诊隐性 / 疑难污染（金标准）

 

对于肉眼和显微镜无法确诊的污染（如支原体、低浓度细菌/真菌、交叉污染），需通过特异性检测方法明确，避免误判或漏判。

 

污染类型      推荐检测方法   检测原理   优势   注意事项

 

支原体污染 1.荧光染色法（常用）：用 DAPI 或 Hoechst 33258 染色；2.PCR 法（金标准）：针对支原体 16S rRNA 基因设计引物，扩增后电泳检测；3.培养法：将细胞上清接种至支原体专用培养基，观察是否有菌落生长。 1.荧光显微镜下，支原体呈“点状荧光”附着在细胞表面或细胞核周围（细胞 DNA 呈块状荧光，易区分）；2.阳性样本可扩增出特定大小条带；3.支原体在专用培养基上形成“煎蛋状”菌落。 1.荧光法快速（2-4h 出结果）；2.PCR 法灵敏度高（可检测 10 个/mL 支原体）；3.培养法可确认活性。 1.荧光法需排除细胞碎片干扰；2.PCR 法需设置阴性对照（无支原体细胞）和阳性对照（已知支原体样本），避免假阳性。

 

细菌/真菌污染（低浓度） 1. 无菌培养法：取 100μL 细胞上清，接种至 LB 培养基（细菌）或 PDA 培养基（真菌），37培养 24-48h，观察是否有菌落；2.革兰染色法：取少量细胞悬液涂片，革兰染色后显微镜观察（细菌呈紫色 / 红色，真菌呈紫色菌丝）。 1.阳性样本会形成特征性菌落；2.革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色，可进一步明确细菌类型。 1.培养法可检测极低浓度污染（1-10 个 /mL）；2.革兰染色可快速区分细菌类型，指导后续消毒。 1.培养法需严格无菌操作，避免环境污染干扰；2.真菌培养需延长至 72h，部分霉菌生长缓慢。

 

交叉污染 1.短串联重复序列（STR）分型（金标准）：检测细胞基因组中的 STR 位点，与标准细胞系 STR 数据库比对；2.免疫荧光法：用特异性抗体染色，显微镜观察是否有 “异常标志物阳性细胞”。 1. 交叉污染细胞的 STR 分型与原始细胞系不一致，会出现额外 STR 峰；2.异常细胞会表达原始细胞系不具备的表面标志物。 1.STR 分型准确率 > 99%，是细胞系身份鉴定的国际标准；2.免疫荧光法快速（1-2h），可直观观察污染细胞。 1.STR 分型需送专业检测机构，成本较高；2.免疫荧光法需选择特异性高的抗体，避免交叉反应。

 

四、关键判断误区与注意事项

 

1、避免将“正常现象”误判为污染：

 

细胞碎片/凋亡小体：细胞解冻后少量死亡属正常（通常 < 20%），凋亡小体无自主运动，数量不随时间增加，而污染会随培养时间快速扩散；

 

培养基沉淀：低温保存的培养基可能出现絮状沉淀（血清蛋白析出），37预热后可溶解，且显微镜下无微生物形态，与污染沉淀（不溶解、有运动性）区分。

 

2、检测时机：

 

显性污染（细菌、真菌）：复苏后 24-72h 内，每天观察 1-2 次，早期干预可减少损失；

 

隐性污染（支原体）：复苏后 1 周、2 周各检测 1 次，或每传代 2-3 次检测 1 次（支原体潜伏期长，早期可能无细胞形态变化）；

 

交叉污染：新细胞系复苏后，或传代 10 次以上，建议做 1 次 STR 分型（避免长期培养中混入其他细胞）。

 

3、污染确认后的处理原则：

 

细菌 / 真菌污染：轻度污染（细胞仍有活性）可尝试用含双抗（青霉素 + 链霉素）的培养基连续换液 3 天；重度污染（培养基浑浊、细胞大量死亡）直接丢弃，并用含次氯酸钠的消毒液清洁培养环境，避免扩散；

 

支原体污染：普通细胞建议丢弃；珍贵细胞可使用支原体清除试剂处理 1-2 周，期间每周检测，确认阴性后继续培养；

 

交叉污染：一旦确认，该细胞系失去实验价值，需立即丢弃，避免污染其他细胞系。

 

五、总结

 

细胞解冻培养中污染的判断，需遵循“肉眼初筛→显微镜确认→特异性检测确诊”的流程：

 

细菌、真菌污染：优先通过“培养基浑浊 + 显微镜下微生物形态”快速判断；

 

支原体污染：依赖“细胞形态异常 + 荧光染色 / PCR 检测”确诊；

 

交叉污染：需通过 STR 分型等分子生物学手段明确。

 

早期精准判断污染类型，不仅能及时止损，还能为后续环境消毒、细胞复苏方案优化提供依据，保障细胞培养的稳定性。

 

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