小鼠冠状动脉内皮细胞的处理与培养方法及实验步骤！

小鼠冠状动脉内皮细胞的培养实验步骤需依据获取途径，按不同的操作规范处理。若直接采购商业细胞株，按对应供应商推荐的操作指引培养。

1、细胞接收与初步处理：

收到细胞后，用 75% 酒精消毒 T25 细胞培养瓶瓶身，拆下封口膜，放入 37、5% CO、饱和湿度的细胞培养箱中静置 3-4 小时，以稳定细胞状态。

2、传代培养准备：

当细胞汇合度达 80% 左右时可进行传代。首先吸出 T25 细胞培养瓶中的培养基，使用 PBS 对细胞清洗 1 次。

3、消化细胞：

添加 0.25% 胰蛋白酶消化液 1 mL 至培养瓶，轻微转动让消化液覆盖瓶底，之后吸出多余消化液，37 温浴 1-3 分钟。需在倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆，再加入 5 mL 完全培养基终止消化。

4、传代接种：

用吸管轻轻吹打混匀细胞，按 1:2 传代比例接种至新的 T25 培养瓶，再补充新鲜的完全培养基至 5 mL，置于 37、5% CO、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。

5、后续培养与换液：

待细胞完全贴壁后进行日常观察，每隔 2-3 天更换新鲜的完全培养基。

若需从实验小鼠体内原代分离并培养，步骤则为：

1、心脏取材：

选取适宜日龄的 SPF 级小鼠，快速处死并取出心脏，将其置于预冷且含双抗（青霉素与链霉素）的 PBS 缓冲液内，反复冲洗清除血液。

2、冠状动脉分离：

在体视显微镜辅助下剥离冠状动脉，并将其剪为 1-2 毫米的小段。

3、酶解消化：

把小段血管放入酶解液，比如 0.1% 胶原酶或混合酶液，37 孵育 15-20 分钟，孵育中适当轻柔吹打。

4、获取单细胞悬液：

消化完成后，用含血清的培养基终止消化，然后将其过 70μm 细胞筛，收集过滤后的细胞悬液，低速离心去除上清，沉淀细胞用适量完全培养基重悬。

5、细胞纯化：

可采用差速贴壁法，让悬液先贴壁 1-2 小时，收集未贴壁细胞转移至新器皿继续培养。或使用 CD31 等内皮细胞特异性抗体搭配磁珠分选，提升细胞纯度。

6、接种与培养：

将纯化后的细胞接种至包被鼠尾胶原或明胶的培养器皿内，放入 37、5% CO 的培养箱，待细胞贴壁后，按每 2-3 天 1 次的频率更换培养基。

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