RNA提取实验中DNA污染的主要来源与清除方法及注意事项！

 

百欧博伟生物：在分子生物学领域，RNA的提取是一项至关重要的实验技术。在RNA提取实验中，DNA污染是常见问题，可能干扰下游实验。以下是DNA污染的来源及清除方法，按逻辑分层整理：

 

一、DNA污染的主要来源

 

1、细胞裂解不充分

 

原因：裂解液未彻底破坏核膜，导致基因组DNA（gDNA）释放到裂解液中。

 

高污染风险样本：富含核酸酶抑制剂的样本（如植物组织、血液）或细胞壁较厚的样本（如细菌、真菌）。

 

2、内源性DNA残留

 

线粒体DNA、叶绿体DNA（植物）或质粒DNA（细菌）可能伴随RNA共同释放。

 

3、外源性DNA污染

 

操作环境（如气溶胶携带质粒DNA）、试剂污染（如未灭菌的离心管）或交叉污染（如共用移液器）。

 

4、机械剪切力不足

 

长链DNA未充分断裂，在后续纯化步骤中未被有效分离。

 

5、试剂/耗材交叉污染

 

使用未灭活的DNase或RNA提取柱残留DNA（如上一批次纯化的DNA未洗净）。

 

二、DNA污染的清除方法

 

1、DNase I 消化法

 

原理：加入DNase I酶（需Mg²激活）选择性降解DNA，保留RNA。

 

关键步骤：

 

消化后灭活：用EDTA（螯合Mg²）或加热（65, 10分钟）终止反应。

 

注意：某些试剂盒提供on-column DNase处理，直接在纯化柱上消化DNA，避免RNA损失。

 

2、优化裂解条件

 

提高裂解效率：

 

增加裂解液强度（如含SDS或异硫氰酸胍的裂解液）。

 

延长裂解时间或配合机械破碎（如匀浆器、玻璃珠震荡）。

 

控制裂解温度：低温（4）抑制核酸酶活性，但可能降低裂解效率，需平衡条件。

 

3、选择性结合法

 

硅胶膜纯化柱：

 

高盐条件下RNA结合到硅胶膜，DNA因电荷或大小差异被洗脱（需结合DNase处理）。

 

LiCl沉淀法：

 

利用LiCl选择性沉淀RNA（DNA保留在上清中），但可能损失小RNA。

 

4、酸性酚-氯仿抽提

 

原理：酸性条件（pH 4-5）下DNA进入有机相，RNA保留在水相。

 

注意：需严格分层，避免吸入中间蛋白层或有机相。

 

5、机械或化学剪切DNA

 

超声破碎：剪切长链DNA（需在冰上操作以防RNA降解）。

 

加热处理：短时间高温（70, 5分钟）破坏DNA二级结构，促进后续分离。

 

三、污染清除效果验证

 

1、电泳检测：RNA样本在琼脂糖凝胶上应无基因组DNA条带（如28S/18S rRNA清晰，无弥散DNA拖尾）。

 

2、qPCR无逆转录对照（-RT control）：若未加逆转录酶的样本出现Ct值，提示DNA残留。

 

3、Nanodrop/A260/A280比值：比值接近2.0提示RNA纯度较高（但无法区分DNA/RNA污染）。

 

四、注意事项

 

1、DNase处理后的灭活：残留DNase可能降解后续实验中的质粒DNA，需彻底灭活。

 

2、避免过度消化：DNase I长时间作用可能损伤RNA（尤其在高温下）。

 

3、样本类型差异：

 

植物样本：建议结合CTAB法去除多糖并多次DNase处理。

 

血液样本：注意白细胞裂解后释放的gDNA，可预先用红细胞裂解液处理。

 

五、不同下游实验的污染容忍度

 

实验类型  可接受的DNA污染阈值   推荐去DNA策略

 

qRT-PCR   极低（<0.1%）       On-column DNase + 柱纯化

 

RNA-seq   低（需<1%）        DNase I消化 + LiCl沉淀

 

Northern Blot  中等          常规柱纯化或酸性酚抽提

 

通过针对性优化裂解和纯化步骤，可有效降低DNA污染风险。若污染持续存在，建议更换试剂盒或引入gDNA吸附剂。

 

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