培养基高压蒸汽灭菌失败的常见原因分析及其应对方法！

 

百欧博伟生物：高压蒸汽灭菌是培养基灭菌最常用的方法，其原理是通过 121（103.4kPa）下维持 15-30 分钟（根据培养基体积调整），利用饱和蒸汽的高温杀灭包括芽孢在内的所有微生物。灭菌失败会导致培养基污染，直接影响实验结果。以下从设备、操作、培养基自身三个维度分析常见失败原因及应对方法：

 

一、灭菌设备相关原因

 

灭菌器的性能和状态是灭菌成功的基础，设备故障或参数异常是常见诱因。

 

1、灭菌器压力 / 温度未达标

 

表现：灭菌过程中显示压力正常，但实际温度未达到 121（如仅 115），导致芽孢未被杀灭。

 

原因：

 

灭菌器内非饱和蒸汽过多（蒸汽中含大量冷凝水，或蒸汽发生器水位过高，蒸汽含水量超标），饱和蒸汽比例不足会降低灭菌温度（相同压力下，饱和蒸汽温度高于湿蒸汽）。

 

压力表或温度传感器校准失效（长期未校准，显示值与实际值偏差）。

 

灭菌器密封不良（如密封圈老化），导致蒸汽泄漏，压力无法维持。

 

应对：

 

灭菌前检查蒸汽发生器水位（避免过高或过低），确保蒸汽干燥度（可通过排放冷空气时观察，排出的蒸汽应呈“直线状”而非“雾状”）。

 

定期校准压力表和温度传感器（建议每年至少 1 次）。

 

每次使用前检查密封圈是否完好，若老化、变形需及时更换。

 

2、冷空气未彻底排尽

 

表现：灭菌器内存在冷空气团，局部温度低于设定值（如冷空气聚集处温度仅 100左右），形成“灭菌死角”。

 

原因：

 

未按规程排放冷空气（如手动排气时时间不足，或自动排气功能故障）。

 

培养基容器摆放过密，遮挡排气口，冷空气无法顺利排出。

 

应对：

 

手动排气：灭菌开始后，先打开排气阀，待有大量蒸汽持续排出（约 3-5 分钟），确认冷空气排尽后再关闭。

 

自动排气灭菌器：需检查排气阀是否通畅，避免被杂质堵塞。

 

摆放规范：容器间留空隙，瓶口朝向一致（避免蒸汽流通受阻），液体培养基瓶装量不超过容器容积的 80%（防止沸腾时液体溢出堵塞排气）。

 

3、灭菌时间不足

 

表现：灭菌时长未达到要求（如大容量培养基仅灭菌 15 分钟），微生物未被完全杀灭。

 

原因：

 

未根据培养基体积调整时间（如 500mL 瓶装培养基需灭菌 30 分钟，若按小体积 15 分钟设定则时间不足）。

 

灭菌器计时错误（如从开始加热时计时，而非达到 121后计时）。

 

应对：

 

明确计时起点：从灭菌器温度达到 121、压力稳定后开始计时。

 

按体积调整时间：一般 200mL 以下灭菌 15-20 分钟，200-500mL 灭菌 20-30 分钟，1000mL 以上需 30-40 分钟。

 

二、操作流程相关原因

 

操作不规范会导致灭菌过程“形式达标但实际失效”，是人为失误的主要来源。

 

1、培养基分装或容器灭菌不当

 

表现：灭菌后培养基污染，污染菌多为环境中的杂菌（如芽孢杆菌、霉菌）。

 

原因：

 

分装时容器未灭菌（如培养皿、试管未提前灭菌，或灭菌后接触非无菌台面）。

 

瓶口 / 管口密封不严（如棉塞松动、瓶盖未拧紧），灭菌时蒸汽无法进入，或灭菌后空气进入时带入杂菌。

 

分装过程中液体洒出瓶口，未清洁即灭菌，残留的有机物在灭菌后成为杂菌滋生的营养源。

 

应对：

 

容器需提前灭菌（如培养皿、试管需单独灭菌后再分装，或分装后整体灭菌时确保容器无菌）。

 

密封规范：棉塞需松紧适宜（既能透气又能防污染），玻璃瓶需用螺旋盖（灭菌时稍松，避免高压下炸裂；灭菌后趁热拧紧）。

 

分装后清洁瓶口：用无菌纱布擦拭残留液体，避免有机物残留。

 

2、灭菌后处理不当导致二次污染

 

表现：灭菌过程合格，但后续操作中引入杂菌（如灭菌后开盖冷却，或取出时接触非无菌环境）。

 

原因：

 

灭菌结束后，未等压力降至“0”即打开灭菌器（内外压力差导致外界空气涌入，带入杂菌）。

 

取出培养基时，容器外壁接触灭菌器内非无菌区域（如灭菌器底部积水、未清洁的内壁）。

 

冷却环境不洁（如在普通台面冷却，而非超净工作台或无菌室）。

 

应对：

 

灭菌后需等待压力自然降至 0，确认无蒸汽喷出后再打开盖子，避免“暴沸”和空气倒灌。

 

灭菌器定期清洁：每次使用后倾倒底部积水，每周用中性清洁剂擦拭内壁，防止水垢和杂菌残留。

 

冷却环节：在超净工作台内或无菌环境中冷却，容器外壁可用 75% 酒精消毒后再取出。

 

三、培养基自身相关原因

 

培养基的成分或状态可能影响灭菌效果，尤其对含特殊成分的培养基需特别注意。

 

1、培养基成分抑制灭菌效果

 

表现：含大量有机物或颗粒的培养基（如含血清、淀粉的培养基）灭菌后仍有杂菌。

 

原因：

 

高浓度有机物（如血清、油脂）会包裹微生物，形成“保护屏障”，蒸汽难以穿透，导致灭菌不彻底。

 

颗粒状成分（如淀粉颗粒、活性炭）内部可能藏匿微生物，灭菌温度无法渗透至颗粒核心。

 

应对：

 

含血清、酶等热敏成分的培养基：需采用“过滤灭菌”（0.22μm 滤膜），而非高压蒸汽灭菌（高温会破坏成分）。

 

含颗粒的培养基：灭菌前充分搅拌，确保颗粒分散；延长灭菌时间（如比常规增加 10-15 分钟），或先溶解颗粒后再灭菌。

 

2、培养基 pH 值异常

 

表现：过酸或过碱的培养基灭菌后易污染，或因高温导致成分分解，间接影响灭菌效果。

 

原因：

 

pH 过低（<5.0）或过高（>8.0）时，培养基成分（如碳水化合物）在高温下易分解，产生酸性或碱性物质，改变灭菌环境，影响微生物杀灭效果。

 

过酸环境可能导致容器（如玻璃试管）腐蚀，产生杂质污染。

 

应对：

 

灭菌前调整 pH 至适宜范围（多数培养基 pH 为 7.0-7.4），用 pH 计或精密试纸检测。

 

对过酸 / 过碱的培养基，可先中和至中性再灭菌，避免成分分解。

 

四、灭菌失败的判断与处理

 

若怀疑灭菌失败，可通过以下方法验证：

 

无菌检验：取少量灭菌后的培养基，在 37培养箱中培养 24-48 小时，观察是否有菌落生长（固体培养基）或浑浊（液体培养基）。

 

阳性对照：在灭菌后的培养基中加入已知芽孢菌（如枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢），培养后若有生长，说明灭菌失败。

 

处理方式：灭菌失败的培养基需重新灭菌（若未污染）或直接废弃（已污染），不可用于实验；同时排查上述原因，解决问题后再进行下一次灭菌。

 

五、总结

 

高压蒸汽灭菌失败的核心原因可归纳为“设备不达标、操作不规范、培养基不适配”。解决关键在于：

 

确保灭菌器压力、温度、时间参数准确，冷空气彻底排出；

 

规范分装、摆放和灭菌后处理，避免二次污染；

 

根据培养基类型（成分、体积）调整灭菌方案。

 

通过严格控制每一步骤，可显著降低灭菌失败风险，保证培养基的无菌性。

 

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