UBA培养基的原理和使用方法及具体操作流程与注意事项！

 

UBA 培养基，全称 Universal Beer Agar，虽然名字中有“啤酒”，但现代配方已标准化，不再使用啤酒。它是一种营养丰富、专为培养厌氧菌设计的非选择性培养基。

 

一、UBA培养基原理

 

1、丰富的营养基础：

 

蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏：提供细菌生长所需的氮源、碳源、维生素、矿物质和氨基酸等复杂营养物质，满足厌氧菌苛刻的营养需求。

 

葡萄糖：提供易被快速利用的碳源和能源。

 

可溶性淀粉：作为碳源补充，同时被认为可能有助于吸收培养过程中产生的有毒代谢产物（如脂肪酸），从而促进某些厌氧菌的生长。

 

2、创造厌氧环境的关键成分：

 

半胱氨酸盐酸盐或硫乙醇酸盐：这是UBA作为厌氧培养基的核心原理所在。这些化合物是强还原剂。

 

它们能有效消耗培养基中的溶解氧。

 

它们能降低培养基的氧化还原电势（Eh），使其达到厌氧菌生长所需的低Eh水平（通常<-150mV）。严格厌氧菌缺乏足够的酶系统（如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶）来中和有氧代谢产生的有毒氧自由基（如过氧化氢、超氧阴离子），因此必须在低Eh环境下才能生存和繁殖。

 

刃天青（常作为指示剂添加）：这是一种氧化还原指示剂。

 

氧化状态呈粉红色或紫色。

 

还原状态呈无色。

 

当培养基被正确还原且保持厌氧时，刃天青应变为无色，直观地指示内部环境适合厌氧菌生长。如果看到粉红色，则表明有氧存在，环境不适合严格厌氧菌。

 

3、其他成分：

 

氯化钠：维持等渗环境。

 

琼脂（Agar）：提供固体支持（用于UBA琼脂平板）。液体形式则不添加琼脂。

 

磷酸氢二钾：缓冲剂，帮助稳定培养基pH。

 

二、UBA培养基使用方法

 

(一) 培养基制备

 

称量溶解：按产品说明书准确称取规定量的UBA干粉培养基。将其悬浮于适量（通常是1升）的蒸馏水或去离子水中。

 

加热煮沸：边搅拌边加热至完全溶解（避免烧焦）。

 

调节pH：冷却至室温后，用1N NaOH或1N HCl将pH调节至6.8 ± 0.2（具体pH值参照说明书，不同品牌可能略有差异）。注意：pH调节应在灭菌前进行。

 

分装：

 

液体培养基（UBB）：将溶液分装至试管或烧瓶中。装液量不宜超过容器体积的一半（如试管装10-15ml），以保证深部有足够的厌氧层。通常添加少量（约0.1%）琼脂（如0.1g/L）或使用大理石碎片/浮珠，有助于限制氧气扩散。

 

固体培养基（UBA琼脂平板）：加入所需量的琼脂（通常约1.5%），重新加热煮沸使琼脂完全溶解。稍冷却（约50°C）后，无菌操作倒入无菌培养皿（约15-20ml/90mm皿）。

 

灭菌：采用高压蒸汽灭菌。标准条件是 121°C (15 psi) 灭菌15分钟。

 

重要提示：灭菌后，必须让培养基缓慢冷却至50°C左右再分装（液体）或倒平板（固体）。快速冷却可能导致玻璃器皿破裂或琼脂凝固不均匀。

 

还原（若需要）：对于极其敏感的严格厌氧菌，灭菌冷却后，可在无菌条件下向液体培养基或刚融化的琼脂（冷却至50°C）中加入少量新鲜配制的无菌还原剂溶液，并重新短暂加热驱除溶解氧，然后迅速冷却并置于厌氧环境中。刃天青指示剂应变为无色。

 

(二) 接种与培养

 

样品处理：根据样品来源（临床样本如脓液、组织、粪便；环境样本如土壤、淤泥；食品样本等）进行适当的前处理（如匀浆、稀释）。

 

接种：

 

液体培养基 (UBB)：用无菌吸管或接种环将样品或纯培养物接种到培养基中。接种后轻轻摇匀。

 

固体培养基 (UBA平板)：可用划线法、涂布法或点种法接种样品或纯培养物。

 

创造厌氧环境：这是成功培养厌氧菌的关键步骤。

 

厌氧罐/罐系统：最常用。将接种好的试管或平板放入厌氧罐中。使用商业厌氧产气袋（通常含硼氢化钠/柠檬酸、碳酸氢钠/柠檬酸混合物，产生H和CO）或钢瓶通入混合气体（如80% N, 10% H, 10% CO）。H在罐内钯催化剂作用下与残余O反应生成水，达到厌氧状态。罐内放置刃天青指示条确认厌氧状态（无色）。

 

厌氧工作站（手套箱）：整个操作（接种、培养、观察）都在持续通入无氧混合气体（N/H/CO）的密闭箱内进行，是最理想的厌氧环境。

 

深层琼脂穿刺：对于UBB，接种后加入一层无菌液体石蜡或熔化的无菌琼脂（约1-2cm厚）封住液面，隔绝氧气。

 

培养：

 

温度：通常选择 35-37°C 培养，适合大多数临床和环境厌氧菌。特定菌种可能需要不同温度（如25-30°C或42°C）。

 

时间：厌氧菌生长通常较需氧菌慢。至少培养48小时，对于生长缓慢的菌种或从复杂样品中初代分离，通常需要培养5-7天甚至更长时间（如2周）。每天或定期观察。

 

观察与判读：

 

液体培养基 (UBB)：观察浑浊度、沉淀、产气（气泡）、颜色变化（如指示剂）、气味（厌氧菌常有特殊臭味）。取培养物涂片染色镜检。

 

固体培养基 (UBA平板)：观察菌落形态（大小、形状、边缘、隆起度、颜色、透明度、光泽）、溶血情况（是否在血琼脂版上产生溶血环）。进行纯化、染色镜检和生化鉴定。

 

三、关键注意事项

 

厌氧环境至关重要：从样品采集、运输、处理到接种、培养，每一步都需尽可能减少暴露于空气的时间，并使用预还原的培养基或快速转移至厌氧系统。厌氧罐/工作站的使用和指示剂验证是核心。

 

新鲜培养基：制备好的UBA培养基（尤其是液体）应尽快使用。储存时间过长可能导致氧气渗入，Eh升高。平板可密封于厌氧袋中冷藏保存，但使用前最好在厌氧环境下放置一段时间恢复还原状态。

 

延长培养时间：不要过早丢弃培养物。许多重要的厌氧菌生长缓慢。

 

质量控制：使用前用已知的标准厌氧菌株和需氧菌株进行质控，确保UBA支持厌氧菌生长而抑制需氧菌（在厌氧条件下）。

 

安全防护：某些厌氧菌（如肉毒梭菌、破伤风梭菌）是强致病菌，操作应在相应生物安全级别的实验室进行。

 

四、总结

 

UBA培养基的核心原理在于其丰富的营养成分和通过还原剂（半胱氨酸/硫乙醇酸盐） 创造并维持低氧化还原电势（Eh）的厌氧环境，满足严格厌氧菌的生长需求。其成功应用的关键在于严格的无氧操作流程（使用厌氧罐或工作站）和足够的培养时间。它是分离和培养临床、环境样本中梭菌及其他厌氧菌的基础培养基之一。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！