血平皿上对细菌进行鉴定和计数的操作流程与注意事项！

 

百欧博伟生物：在血平皿上对细菌进行鉴定和计数是微生物学实验的基础操作，结合了菌落形态观察、生化特性分析及计数方法，具体流程如下：

 

一、细菌计数（活菌计数）

 

血平皿计数主要采用平板菌落计数法，适用于样品中活菌数量的定量分析（如临床标本中致病菌浓度、环境样品污染程度等）。

 

操作步骤：

 

1、样品稀释

 

若样品中菌量较高（如痰液、脓液），需先进行梯度稀释（通常用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，稀释倍数为 10¹、10²……10），确保每个平板上生长的菌落数在30-300 个（此范围计数结果更准确）。

 

2、接种与培养

 

取不同稀释度的样品（通常 0.1-0.2 mL），均匀涂布于血平皿表面，或采用倾注法（样品与冷却的培养基混合后倾注平板）。

 

培养条件：35-37，需氧或厌氧环境（根据目标菌特性，如链球菌需 5% CO环境），培养 18-24 小时（苛养菌可能需 48 小时）。

 

3、计数计算

 

选择菌落数在 30-300 个的平板，统计总菌落数，按以下公式计算：

 

每克（或每毫升）样品活菌数 = 平板菌落数 × 稀释倍数 ÷ 接种体积

 

例：10稀释度的样品接种 0.1 mL，平板上有 50 个菌落，则活菌数 = 50 × 10 ÷ 0.1 = 5×10 CFU/mL（CFU：菌落形成单位）。

 

二、细菌鉴定（结合形态与生化特性）

 

血平皿上的细菌鉴定需通过菌落形态观察、溶血特性分析、生化反应及分子生物学方法逐步确认，具体步骤如下：

 

1、初步观察：菌落形态与溶血特性

 

菌落形态：记录菌落的大小（直径）、形状（圆形、不规则）、边缘（整齐、锯齿状）、表面（光滑、粗糙）、颜色（白色、黄色、灰色）、透明度（透明、半透明、不透明）、凸起程度（扁平、隆起）等。

 

例：金黄色葡萄球菌菌落通常为圆形、光滑、凸起、金黄色；肺炎链球菌菌落较小、扁平、边缘呈 “脐状”（培养 48 小时后中央凹陷）。

 

溶血特性：根据血平皿上的溶血环类型（α、β、γ 溶血，见前文）初步缩小范围。

 

例：β- 溶血的革兰阳性球菌可能为 A 群链球菌或金黄色葡萄球菌；α- 溶血的革兰阳性球菌可能为肺炎链球菌。

 

2、染色与显微镜观察

 

挑取单个菌落进行革兰染色，通过细菌的染色性（革兰阳性 / 阴性）、形态（球菌 / 杆菌）、排列方式（链状、葡萄状、成对）进一步鉴定。

 

例：

 

革兰阳性球菌，呈葡萄状排列 → 疑似葡萄球菌属；

 

革兰阳性球菌，呈链状排列，β- 溶血 → 疑似链球菌属。

 

3、生化反应与特异性试验

 

根据初步判断的菌属，选择针对性生化试验确认菌种：

 

葡萄球菌属鉴定：

 

凝固酶试验：金黄色葡萄球菌凝固酶阳性，表皮葡萄球菌阴性；

 

甘露醇发酵试验：金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇产酸，其他葡萄球菌多为阴性。

 

链球菌属鉴定：

 

杆菌肽敏感试验：A 群链球菌对杆菌肽敏感（抑菌环≥10 mm），其他 β- 溶血链球菌多耐药；

 

奥普托欣试验：肺炎链球菌敏感（抑菌环≥14 mm），其他 α- 溶血链球菌耐药。

 

肠球菌属：

 

耐盐试验（6.5% NaCl 培养基生长）和胆汁七叶苷试验阳性，可与其他链球菌区分。

 

4、分子生物学与自动化鉴定（进阶方法）

 

PCR 技术：通过扩增特异性基因（如葡萄球菌的 nuc 基因、链球菌的 16S rRNA 基因）快速鉴定。

 

质谱分析：通过细菌蛋白质图谱与数据库比对，实现快速、准确的种水平鉴定，适用于复杂或罕见菌株。

 

自动化鉴定系统：通过预制生化反应板，结合仪器读数判断菌种。

 

三、注意事项

 

纯培养优先：鉴定前需通过划线分离获得单个菌落，避免杂菌干扰。

 

培养条件匹配：部分细菌需特殊环境，否则可能不生长或溶血特性异常（如肺炎链球菌在厌氧环境下可呈 β- 溶血）。

 

结果综合判断：单一试验可能存在交叉反应（如某些凝固酶阴性葡萄球菌也可能发酵甘露醇），需结合菌落形态、染色结果及多项生化试验综合判定。

 

通过以上步骤，可从血平皿上的细菌菌落中实现准确计数和菌种鉴定，为临床诊断、微生物研究提供关键依据。

 

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