微生物冻干粉菌种的复苏与接种及培养标准操作规程！

 

一、菌种复苏

 

1、实验准备

 

无菌操作台（提前30分钟开启紫外灭菌）

 

配套液体培养基（按菌种特性选择）

 

无菌移液器具（1mL移液枪及无菌枪头） 

 

接种环（酒精灯灭菌备用） 

 

适宜固体培养基（营养琼脂平板/斜面） 

 

恒温培养箱（提前校准温度）

 

2、操作流程

   

(1)表面消毒

       

使用75%酒精棉球对冻干粉安瓿瓶进行三次 擦拭消毒（每次旋转90°）   

 

(2)开启容器       

 

在生物安全柜内操作

       

沿铝盖压痕方向撕开外层密封

       

无菌镊子取下橡胶塞   

 

(3)水化复苏       

 

预温配套培养基至30±2

       

缓慢加入0.5-1mL培养基（沿管壁）

       

静置5分钟使冻干粉充分溶解

       

轻柔涡旋混匀（避免产生气泡）   

 

(4)初级培养

       

取100μL菌悬液划线接种于平板

       

剩余悬液转移至液体培养基

       

明确标注：菌株编号+代次+日期+操作者   

 

(5)培养观察

       

平板倒置培养

       

设置双温度培养（最适温度±5）       

 

每8小时观察生长状况

 

二、接种与传代

 

1、接种方法

   

(1)平板四区划线法

       

接种环灭菌冷却后取单菌落

       

依次完成4个区域的密集-稀疏划线

       

每区旋转平板60°   

 

(2)液体接种

       

选择对数生长期菌液

       

按1-2%接种量转接

       

添加玻璃珠提高分散度

 

2、培养条件优化

   

(1)需氧菌：保持5% CO环境

   

(2)厌氧菌：使用厌氧培养罐

   

(3)温度梯度：设置3个温差±2的平行样

 

三、质量控制

 

1、纯度验证

   

(1)革兰染色镜检

   

(2)不同温度下培养特性验证

   

(3)生化反应鉴定

 

2、污染防控

   

(1)每批次做空白培养基对照

   

(2)关键步骤设置阳性对照

   

(3)使用选择性抑制剂培养基

 

四、注意事项

 

1、生物安全

   

(1)二级生物安全防护

   

(2)废弃物121高压灭菌30分钟

 

2、保存规范

   

(1)工作菌株不超过5代

   

(2)原始菌株-80超低温保存

   

(3)建立菌种使用台账

 

3、异常处理

   

(1)复苏失败时采用梯度复活法

   

(2)污染菌株立即灭菌处理

   

(3)变异菌株重新分离纯化

 

本规程需配合菌种说明书使用，操作人员应接受专业培训并保留完整实验记录。关键步骤建议双人复核。

 

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