大肠菌群培养基的检验原理和使用方法及注意事项！

 

大肠菌群是卫生微生物学中一类重要的指示菌，主要用于评估食品、饮用水、环境样品等的卫生状况。其检验通常采用选择性培养基进行多管发酵法或滤膜法。最常用的培养基是月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤和煌绿乳糖胆盐肉汤，以及用于分离鉴别的伊红美蓝琼脂。

 

一、核心检验原理：

 

1、选择性生长：

 

胆盐或表面活性剂：抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长（如芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌等），但对大多数革兰氏阴性菌（包括大肠菌群）抑制作用较弱或没有抑制作用。

 

煌绿（亮绿）：一种抑菌染料，进一步抑制非目标革兰氏阳性菌和部分非大肠菌群的革兰氏阴性菌的生长。

 

2、指示发酵：

 

乳糖作为唯一碳源：培养基中含有乳糖作为主要可发酵糖类。

 

酸碱指示剂（如溴甲酚紫、中性红）：大肠菌群若能发酵乳糖，就会产酸（主要是乳酸、乙酸等）。产酸使培养基pH下降，导致酸碱指示剂变色。

 

产气检测：大肠菌群发酵乳糖时还会产生气体（主要是CO和H）。在液体培养基中，通常使用倒置的杜汉氏小管来收集产生的气体。小管顶部出现气泡（无论大小）即为产气阳性。

 

3、验证与鉴定（确证试验）：

 

初发酵阳性的样品（产酸产气），需要进一步接种到鉴别性固体培养基上进行验证。

 

伊红美蓝琼脂：大肠菌群（特别是典型的大肠杆菌）在EMB上会形成具有金属光泽的深紫色或紫黑色菌落。这是因为它们能强烈发酵乳糖产酸，使伊红和美蓝结合并沉淀在菌落表面。其他非大肠菌群的乳糖发酵菌（如产气肠杆菌）通常形成棕色或粉红色、无金属光泽的菌落。非乳糖发酵菌形成无色或浅琥珀色菌落。

 

EC肉汤：在44.5±0.2°C下培养，用于检测耐热大肠菌群（主要是大肠杆菌）。产气为阳性。

 

二、常用培养基及使用方法（以多管发酵法为例）：

 

1、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤：

 

用途：大肠菌群检验的初发酵（推定试验）。

 

原理：月桂基硫酸盐抑制革兰氏阳性菌，乳糖作为发酵底物，溴甲酚紫作为酸碱指示剂。

 

成分（典型）：胰蛋白胨、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠、溴甲酚紫。

 

使用方法：

 

制备：按说明书称量，加热溶解于蒸馏水中，分装于带杜汉氏小管的试管（如10mL/管）。121°C高压灭菌15分钟。

 

接种：将不同稀释度的样品匀液（或原液）接种于LST管中（如接种1mL于10mL LST管）。

 

培养：35±0.5°C培养24±2小时。

 

观察：检查杜汉氏小管内是否有气泡（产气）以及培养基颜色是否由紫色变为黄色（产酸）。

 

结果判定：产酸（变黄）且产气（小管内有气泡）的管为初发酵阳性（推定阳性）。仅产酸不产气或仅产气不产酸（较少见）通常视为阴性。24小时未产气的管可继续培养至48小时再观察一次。

 

2、煌绿乳糖胆盐肉汤：

 

用途：大肠菌群检验的复发酵（确证试验）。用于验证LST初发酵阳性的结果。

 

原理：胆盐和煌绿提供更强的选择性，抑制非大肠菌群细菌。乳糖发酵产酸产气为确证阳性。

 

成分（典型）：蛋白胨、乳糖、牛胆盐、煌绿、蒸馏水。

 

使用方法：

 

制备：按说明书称量溶解，分装于带杜汉氏小管的试管（如10mL/管）。121°C高压灭菌15分钟（注意煌绿遇热不稳定，灭菌温度和时间需严格控制）。

 

接种：用接种环从初发酵阳性（LST产酸产气）的试管中取培养物，转种到BGLB肉汤管中。

 

培养：35±0.5°C培养48±2小时。

 

观察：检查产气情况（杜汉氏小管内有气泡）。

 

结果判定：48小时内产气的BGLB管报告为大肠菌群阳性（确证阳性）。不产气为阴性。

 

3、伊红美蓝琼脂：

 

用途：大肠菌群（尤其是大肠杆菌）的分离培养和鉴别。常用于平板计数法或作为确证试验的一部分。

 

原理：伊红和美蓝作为指示剂。强发酵乳糖产酸的大肠菌群（尤其大肠杆菌）使染料结合沉淀，形成带金属光泽的深紫色/紫黑色菌落。弱发酵菌形成棕色/粉红色菌落。非发酵菌形成无色菌落。

 

成分（典型）：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、伊红Y、美蓝。

 

使用方法：

 

制备：按说明书称量，煮沸溶解于蒸馏水（避免过度加热），冷却至约45-50°C，倾注无菌平板。

 

接种：划线或涂布接种可疑菌落或样品稀释液。

 

培养：35±0.5°C培养18-24小时。

 

观察：挑取具有典型金属光泽的深紫色或紫黑色菌落进行革兰氏染色镜检（应为革兰氏阴性无芽孢杆菌）和生化确证试验。

 

结果判定：典型菌落形态是鉴别的初步依据，需结合镜检和生化试验最终确认是否为大肠菌群（特别是大肠杆菌）。

 

三、总结流程（多管发酵法示例）：

 

1、样品处理与稀释：制备样品匀液及适当稀释度。

 

2、初发酵（推定试验 - LST）：

 

接种不同稀释度样品于LST管。

 

35°C培养24±2小时（48小时再观察）。

 

记录产酸（变黄）且产气（气泡）的管数。

 

3、复发酵（确证试验 - BGLB）：

 

从所有产酸产气的LST管中取培养物，转种到BGLB管。

 

35°C培养48±2小时。

 

记录产气（气泡）的BGLB管数。

 

4、报告结果（MPN法）：根据初发酵接种的稀释度和确证阳性的BGLB管数，查最可能数表，报告样品中大肠菌群的MPN值（单位如：MPN/g或MPN/mL）。

 

四、重要注意事项：

 

无菌操作：整个实验过程必须严格遵守无菌操作规程。

 

培养基质量控制：使用前应检查培养基是否脱水、污染、变质。定期用标准菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 - 阳性，产气肠杆菌ATCC 13048 - LST阳性BGLB可能阳性/阴性，粪肠球菌ATCC 29212 - 阴性）进行质控。

 

温度控制：培养箱温度必须精确控制在规定范围内（±0.5°C）。

 

杜汉氏小管观察：小管内任何体积的气泡都视为产气阳性。倾斜试管有助于观察微小气泡。

 

确证试验的必要性：初发酵阳性仅表示“可疑”，必须经过复发酵（BGLB）或平板分离（EMB）等确证试验才能报告大肠菌群阳性。

 

标准依据：不同国家、行业（食品、水、药品）有具体的检测标准。必须严格遵循所执行的标准中规定的具体培养基、培养温度、时间和判定方法。

 

生物安全：处理可能含有病原微生物的样品时，应在相应级别的生物安全实验室进行，并做好个人防护。

 

理解培养基的原理是正确使用和解读结果的关键。通过选择性抑制非目标菌，利用目标菌的特定代谢特性（发酵乳糖产酸产气）和指示系统（颜色变化、产气收集），可以有效地检测和计数大肠菌群。

 

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