实验室无菌操作的核心原则与要求及无菌室的管理要求！

 

百欧博伟生物：实验室无菌操作和无菌室管理是确保实验（尤其是微生物学、细胞培养、分子生物学等）结果准确可靠、防止交叉污染和保障人员安全的关键。以下是详细的要求和规范：

 

一、无菌操作的核心原则与要求

 

1、环境控制：

 

在指定区域进行：所有无菌操作必须在无菌室、生物安全柜（BSC）或超净工作台内进行。这些区域经过净化处理，提供单向层流（通常是垂直或水平）的空气，保护工作区域免受外部污染。

 

避免气流干扰：操作时尽量减少在开放区域走动，避免快速开关门，禁止在操作区域上方传递物品，以免破坏气流屏障。

 

操作前准备：确保工作区域清洁无菌。使用前，用70-75%乙醇或其他批准的消毒剂彻底擦拭工作台面、设备外表面（如移液器、试剂瓶）以及手套。

 

2、人员要求与行为规范：

 

着装规范：

 

进入无菌室前必须更换专用洁净服（连体服或大褂）、帽子（完全包住头发）和口罩（覆盖口鼻）。

 

必须穿戴无粉、灭菌的一次性手套。手套在接触非无菌表面（如门把手、电话、记录本）后、操作不同样品前、或明显污染后必须立即更换或用酒精彻底消毒。操作过程中避免触摸脸部、头发等。

 

必要时佩戴护目镜或面罩。

 

个人卫生：进入前彻底洗手（使用抗菌洗手液，遵循七步洗手法），并用酒精消毒。长发必须束起完全包裹在帽子里。禁止佩戴首饰（手表、戒指、手链等）。

 

行为规范：

 

动作要轻缓、准确、有序，避免剧烈动作产生气流或扬尘。

 

禁止在无菌室内交谈、咳嗽、打喷嚏。如需说话，务必侧身避开工作区。

 

禁止在无菌室内饮食、吸烟、嚼口香糖、存放个人物品。

 

尽量减少在无菌室内的停留时间和人员数量。

 

操作时身体和手臂避免越过开放的培养皿、试剂瓶口或细胞瓶口上方。

 

3、物品准备与处理：

 

灭菌：所有直接接触无菌区域或样品的物品（培养皿、吸头、移液管、试剂瓶、手术器械、培养基等）必须经过有效的灭菌处理（高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤除菌、辐照灭菌等），并在有效期内使用。灭菌指示胶带/标签应显示灭菌成功。

 

无菌传递：

 

尽量使用带有螺旋盖或橡胶塞的容器，避免使用棉塞（易脱落纤维）。

 

物品进入无菌操作区前，外表面必须用消毒剂擦拭干净。

 

使用火焰灼烧玻璃器皿口（如瓶口、试管口）和金属器械（如镊子、接种环）进行灭菌，并充分冷却后再接触样品或培养基（避免烫死细胞/微生物）。灼烧后避免触碰非无菌表面。

 

打开包装（如吸头盒、培养皿包装）时，确保内表面不接触非无菌表面或手套污染部位。

 

摆放：

 

工作台面物品摆放整齐有序，只放置本次操作必需的物品。

 

无菌物品（如开盖的培养瓶、培养皿）应放置在洁净气流的下游区域（对于垂直流超净台，放在台面靠后位置；对于水平流，放在远离操作者的一侧）。

 

污染性物品（如用过的吸头、废弃的培养物）应放置在专用废弃容器内（如含消毒液的废液缸、生物危害袋），并置于气流的下游或侧方，避免污染无菌物品和工作区。

 

4、操作技术：

 

开盖/揭盖：培养皿盖或试剂瓶盖打开后，应倒置放置或拿在手中，避免内表面朝上接触空气落菌。操作时盖子离开开口的时间越短越好。

 

移液：

 

使用无菌移液器和无菌吸头。移液器枪头避免触碰非目标容器壁或台面。

 

吸取液体时，动作平稳，避免产生气泡或液体溅出。

 

排出液体时，吸头尖端轻触容器壁，让液体顺壁流下，避免悬空滴落产生气溶胶。

 

禁止用嘴吸取任何液体！必须使用移液助吸器（移液器、吸球、电吸）。

 

接种/转移：

 

使用无菌的接种环、接种针或巴氏吸管。

 

接种环/针使用前后必须在火焰上彻底灼烧灭菌（烧至红热），并在无菌区域冷却。

 

转移液体时，避免两容器口直接接触。

 

避免交叉污染： 操作不同样品或试剂时，必须更换吸头、吸管、接种环等。手套接触过一种样品后，在操作下一种样品前应用酒精消毒或更换手套。

 

二、无菌室管理要求

 

1、准入与培训：

 

只有经过严格无菌操作规范培训并考核合格的人员方可进入无菌室进行操作。

 

所有人员必须熟知无菌室管理规定、应急处理程序和生物安全知识。

 

建立人员进出登记制度。

 

2、环境清洁与消毒：

 

日常清洁：每次使用前后，用消毒剂彻底擦拭所有工作台面、设备表面（BSC/超净台内外）、椅子、门把手、地面等。清洁工具（抹布、拖把）应专用，使用后妥善消毒处理。

 

定期深度清洁：制定计划，定期（如每周、每月）进行更彻底的清洁，包括墙壁、天花板、设备内部（在专业人员指导下或由专业人员执行）、层流装置表面等。

 

空气消毒：

 

紫外线照射：是常用的方法。在操作前和操作后（人员离开后），开启紫外灯照射至少30分钟（具体时间根据房间大小和灯管功率确定）。重要警告：绝对禁止在紫外灯开启时进入房间或在室内操作，紫外线对人体皮肤和眼睛有严重伤害！紫外灯管需定期清洁（用酒精擦拭）和检测/更换（通常每半年至一年，或根据强度监测结果），确保杀菌效果。

 

其他方法：臭氧发生器、化学熏蒸（如甲醛，需专业人员操作，有严格安全要求）等，用于更彻底的终末消毒，频率较低（如季度、半年或必要时）。

 

消毒剂管理：使用经认证有效的消毒剂，定期更换（防止失效和微生物产生耐受性），并按照说明书正确配制和使用。

 

3、层流设备维护：

 

生物安全柜/超净工作台：

 

每次使用前后进行表面清洁消毒。

 

定期（通常每年一次，或按厂家建议）由有资质的专业机构进行性能检测（包括气流速度、气流模式、高效过滤器完整性噪声、光照度等），确保符合安全标准。

 

高效过滤器（HEPA/ULPA）根据检测结果和使用情况定期更换（通常每3-5年，或阻力过大、效率下降时）。

 

避免在BSC内使用明火（酒精灯），以免破坏气流和损坏高效过滤器。应使用无菌的、一次性接种环或电加热接种环灭菌器。

 

房间层流系统：定期更换初效、中效、高效过滤器，维护风机，确保房间洁净度和压差（通常无菌室对走廊/缓冲间保持正压，防止外部污染进入）。

 

4、物品管理：

 

专用性：无菌室内的物品（设备、耗材、试剂）应尽可能专用，不与非洁净区混用。

 

有序存放：物品应存放在指定位置，标识清晰，保持整洁。无菌耗材应存放在洁净的柜子或抽屉内。

 

废弃物管理：

 

设立专用、标识清晰的生物危害废弃物容器（锐器盒、生物危害袋/桶）。

 

所有接触过生物材料的废弃物必须视为生物危害废物，严格按照实验室生物安全规定进行处理（高压灭菌、化学消毒或交由有资质的单位处理）。

 

废弃物应及时清理，不得在无菌室内堆积。

 

禁止带入：严禁将个人物品（书包、食品、饮料、手机、非实验用文件等）带入核心无菌操作区。必要的记录本和笔应专用并定期消毒。

 

5、环境监测：

 

沉降菌检测：定期（如每月、每季度）在操作期间和操作后，在关键位置（工作台面、BSC内部）放置营养琼脂平板（暴露一定时间，如30分钟），培养后计数菌落数，评估空气和表面的微生物污染水平。结果应符合既定标准。

 

表面微生物检测：使用接触碟或棉拭子法，定期对工作台面、设备表面、手套等进行采样培养监测。

 

尘埃粒子计数：定期检测空气中的尘埃粒子浓度，评估洁净度级别。

 

压差监测：持续监测无菌室与相邻区域的压差，确保维持正压。

 

记录与趋势分析：所有监测结果必须详细记录，并进行分析，发现超标或不良趋势应及时调查原因并采取纠正措施。

 

6、安全与应急：

 

配备必要的应急设备：洗眼器、紧急喷淋装置、急救箱、灭火器、泄漏处理包。

 

制定并张贴清晰的应急预案：包括生物材料泄漏、化学品泄漏、火灾、人员伤害等的处理流程。

 

定期进行安全培训和应急演练。

 

确保紧急出口畅通。

 

7、文件与记录：

 

建立完善的无菌室管理SOP（标准操作规程），包括清洁消毒规程、设备操作维护规程、环境监测规程、人员培训规程、废弃物处理规程、应急预案等。

 

详细记录：人员进出、设备使用、清洁消毒、维护保养、环境监测、培养基/试剂配制与灭菌、废弃物处理、培训、偏差与纠正措施等。所有记录应真实、准确、及时、可追溯。

 

三、总结：

 

无菌操作和无菌室管理是一个系统工程，需要严格的人员培训、规范的操作行为、洁净的环境维护、有效的消毒灭菌、完善的监测体系以及科学的管理制度共同保障。任何环节的疏忽都可能导致污染，影响实验结果甚至威胁人员安全。因此，必须将无菌意识贯穿始终，严格遵守各项规定，并持续改进。

 

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