培养基pH的测定与调整方法及总结关键步骤与重要注意事项！

 

百欧博伟生物：培养基 pH 的测定和调整是细胞培养、微生物培养和生化实验中至关重要的基础步骤。不合适的 pH 会严重影响细胞生长、代谢产物、实验结果的可重复性甚至导致实验失败。以下是详细的步骤和注意事项：

 

一、pH 的测定

 

1、选择合适的测量工具：

 

pH 计 (首选，最精确)：使用经过校准的实验室 pH 计和合适的 pH 电极（通常为复合玻璃电极）。这是最准确、最常用的方法。

 

pH 试纸 (粗略估计)：仅适用于对精度要求不高的情况（如某些植物组织培养或粗略配制），精度较差（通常±0.5），且易受培养基颜色干扰。

 

pH 指示剂 (如酚红)：许多培养基本身含有酚红作为 pH 指示剂。颜色变化范围通常在 pH 6.8 (黄色) 到 pH 8.2 (紫红色) 之间，中性 (pH 7.4) 时为橙色或红色。这种方法只能提供大致范围，不能精确测定。

 

2、pH 计的校准 (关键步骤！)：

 

使用至少两种标准缓冲液（通常是 pH 4.01, 7.00, 10.01，选择涵盖待测溶液预期 pH 范围的标准液）。

 

严格按照 pH 计说明书进行操作。一般步骤：

 

用去离子水彻底冲洗电极。

 

将电极浸入第一种标准缓冲液，待读数稳定后，进行校准（“Cal” 或 “Slope”）。

 

冲洗电极。

 

将电极浸入第二种标准缓冲液（如 pH 4.01 或 pH 10.01，根据预期 pH 选择），待读数稳定后，进行第二次校准（“Cal” 或 “Slope”）。

 

有些仪器可能需要三点校准。校准后检查斜率是否在可接受范围内（通常 >95%）。

 

注意：校准缓冲液需要定期更换，避免污染。电极球泡要保持湿润（通常保存在 KCl 溶液或专用保存液中）。

 

3、测定培养基 pH：

 

将校准好的 pH 电极用去离子水冲洗干净，并用洁净的吸水纸轻轻吸干残留水滴（切勿擦拭电极球泡！）。

 

将电极完全浸入待测的培养基溶液中（确保液面超过电极的参比液接界），轻轻搅拌或晃动溶液（或开启磁力搅拌器）。

 

等待读数稳定（通常需要 30 秒到 1 分钟）。

 

记录稳定的 pH 读数。

 

测量完毕后，立即用大量去离子水彻底冲洗电极。

 

二、pH 的调整

 

1、目标 pH：明确你的实验所需的最终 pH 值（例如，大多数哺乳动物细胞培养为 pH 7.2 - 7.4，细菌培养可能为 6.8 - 7.2 或特定值）。

 

2、调整时机：必须在培养基灭菌（高压蒸汽灭菌或过滤除菌）之前进行 pH 调整。 灭菌过程本身可能会轻微改变 pH。

 

3、调整试剂：

 

升高 pH：使用无菌的 1M NaOH 溶液。对于对钠离子敏感的情况，可使用 1M KOH 溶液 或 碳酸氢钠 (NaHCO) 溶液（后者本身也是缓冲成分）。

 

降低 pH：使用无菌的 1M HCl 溶液。有时也可用 1M 醋酸 或 柠檬酸（特别是在植物或酵母培养基中）。

 

重要提示：强烈建议预先配制好 无菌的 1M NaOH 和 1M HCl 溶液（过滤除菌），并用密封容器储存。直接使用浓酸浓碱操作不便且危险。确保使用的酸/碱溶液无菌，避免污染培养基。

 

4、调整步骤：

 

将待调整的培养基置于洁净容器中（如烧杯或锥形瓶），放置在磁力搅拌器上。

 

开启磁力搅拌器，使培养基缓慢而均匀地搅拌。

 

逐滴缓慢加入 1M NaOH 或 1M HCl 溶液。

 

每加入几滴后，暂停搅拌片刻，将校准好的 pH 电极浸入培养基中，测定当前 pH 值（或使用无菌移液管吸取少量培养基滴在精密 pH 试纸上粗略判断）。

 

关键： 加入酸/碱时要非常缓慢，并充分搅拌，避免局部过酸或过碱导致某些成分（如磷酸盐、钙镁离子）沉淀。沉淀一旦形成很难再溶解。

 

持续少量添加并监测，直至达到目标 pH 值。

 

5、重新测定和确认：调整后，确保溶液混合均匀，再次用 pH 计精确测定最终 pH 值。

 

三、重要注意事项

 

1、温度：pH 测量受温度影响。pH 计通常有自动温度补偿功能。确保校准缓冲液和待测培养基的温度尽量一致（通常在室温 20-25°C 下测量和调整），并在 pH 计上设置正确温度或启用 ATC。注意：培养基在 37°C 时的 pH 会比室温下低约 0.2-0.4 个单位。实验室通常调整室温下的 pH 至目标值（如 7.4），在 37°C 培养时即接近生理 pH（约 7.0 - 7.2）。

 

2、缓冲系统：

 

培养基中的缓冲能力主要来源于 碳酸氢钠/CO 系统 和/或 HEPES, MOPS 等有机缓冲液。

 

碳酸氢钠系统：这是最常用的生理缓冲系统。其 pH 高度依赖于环境 CO 浓度（通常 5-10% CO 用于维持 pH 7.2-7.4）。在空气中（0.03% CO）敞口测量时，CO 会逸出，导致 pH 升高（可能到 8.0 以上）。因此，对于含碳酸氢钠的培养基，pH 调整应在 开放容器中快速完成，并理解在空气中的测量值会高于在 CO 培养箱中的实际值。调整目标是让其在指定 CO 浓度下达到所需 pH。

 

有机缓冲液：添加 10-25mM HEPES 等缓冲液可以大大增强培养基在空气中的缓冲能力，减少 CO 逸出对 pH 的影响，使其在室温空气中测量更接近实际值，也便于在开放环境下短时间操作（如显微镜观察）。但高浓度 HEPES 可能有轻微细胞毒性。

 

3、灭菌的影响：

 

高压蒸汽灭菌：加热会促使 CO 逸出和碳酸分解，通常导致灭菌后 pH 升高。糖类（如葡萄糖）在高温下可能部分降解产生酸性物质，有时会略微降低 pH。总体而言，升高更常见且幅度可能较大（0.2-0.5 单位）。必须在灭菌前将 pH 调得比目标值略低一点（如低 0.1-0.3），并在灭菌后冷却至室温时再次测量确认。如果偏差大，需在无菌条件下微调（使用无菌酸/碱溶液）。

 

过滤除菌：对 pH 影响很小。通常在过滤前调整好 pH 即可。过滤后可直接使用或再次确认。

 

4、无菌条件下的微调：如果灭菌后 pH 偏离目标值较大（尤其是高压灭菌后），必须在超净台内进行无菌操作：

 

使用无菌的 1M NaOH 或 1M HCl 溶液（预先过滤除菌）。

 

使用无菌移液管或注射器吸取酸/碱。

 

逐滴、缓慢、边加边轻轻混匀（如轻轻晃动培养瓶）。

 

如果需要精确测量灭菌后 pH，必须使用无菌的 pH 电极（经酒精或高压灭菌，需确认电极耐受性）或使用无菌取样法将少量培养基取出在超净台外测量（此方法有污染风险，需极其小心）。

 

5、沉淀问题：如前所述，加酸/碱过快或不充分搅拌极易导致磷酸钙、磷酸镁、碳酸钙等沉淀。一旦形成，很难逆转。缓慢加入和充分搅拌是预防的关键。

 

6、热敏感成分：如果培养基中含有热不稳定成分（如某些生长因子、维生素、抗生素），通常在过滤除菌后添加。pH 调整应在这些成分添加之前完成（在基础培养基溶解后调整）。

 

7、安全：操作强酸（HCl）强碱（NaOH）时务必佩戴手套、护目镜，在通风良好的地方进行。避免皮肤接触和吸入蒸气。

 

四、总结关键步骤

 

1、准备：配制好培养基，明确目标 pH 和缓冲系统（是否需要 CO）。

 

2、校准：严格按照规程校准 pH 计。

 

3、测量：在室温、开放环境下测量当前培养基 pH（理解 CO 系统的影响）。

 

4、调整：

 

慢速搅拌培养基。

 

使用无菌 1M NaOH 或 HCl 逐滴、缓慢加入。

 

每加几滴暂停，充分混匀后测定 pH。

 

重复至接近目标 pH（考虑灭菌影响，高压灭菌前可略低于目标值）。

 

5、灭菌：进行高压灭菌或过滤除菌。

 

6、灭菌后确认 (重要！)：待培养基冷却至室温后，在相应环境下（空气中或 CO 培养箱平衡后）测量最终 pH。如有必要，在无菌条件下进行微调。

 

7、添加热敏成分：(如适用) 在无菌条件下加入过滤除菌的热敏感成分。

 

遵循这些步骤并特别注意温度、缓冲系统、灭菌影响和操作细节，就能可靠地测定和调整培养基的 pH，为你的细胞或微生物创造最佳的生长环境。

 

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