微生物发酵培养基常用的优化方法与操作流程及注意事项！

 

微生物发酵培养基的优化是提高目标产物（如酶、抗生素、有机酸、氨基酸、生物燃料、菌体蛋白等）产量、质量和降低生产成本的关键环节。这是一个系统性的工程，需要综合运用多种策略和方法。以下是常用的微生物发酵培养基优化方法，通常分步骤进行：

 

一、初步筛选与单因素实验

 

1、文献调研与经验借鉴：

 

查阅目标菌种或类似菌种相关文献，了解其基础培养基成分和大致比例。

 

参考已有的商业化培养基配方或实验室常用配方。

 

了解目标产物的代谢途径，推测关键营养需求（如特定前体、诱导物、维生素）。

 

2、关键营养源的初步筛选：

 

碳源筛选：测试不同碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、甘油、糖蜜、纤维素水解液等）对菌体生长和产物合成的影响。考察利用率、是否产生分解代谢阻遏、成本等。

 

氮源筛选：测试不同有机氮源（酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉、鱼粉等）和无机氮源（硫酸铵、硝酸铵、尿素、氨水等）及其组合。考察提供氨基酸、生长因子的能力，以及是否产生铵离子抑制。

 

磷酸盐源筛选：测试不同磷酸盐及其浓度，磷酸盐常是生长和次级代谢的关键限制因子。

 

微量元素与维生素：初步考察添加复合微量元素溶液或特定维生素是否有促进作用。

 

3、单因素优化：

 

在基础培养基上，固定其他因素，逐一改变一个因素的浓度/水平（如碳源浓度、氮源浓度、磷酸盐浓度、初始pH、接种量等）。

 

通过测定生物量、产物浓度、底物消耗速率、得率等关键指标，确定该因素的大致适宜范围（如使生物量或产物达到较高的浓度区间）。

 

优点：简单直观，易于操作和理解。

 

缺点：

 

忽略了因素间的交互作用（协同或拮抗），结果可能不是全局最优。

 

实验次数相对较多，效率较低。

 

只能找到局部最优解。

 

二、多因素交互作用优化与统计实验设计

 

这是优化的核心阶段，用于高效探索多个因素及其交互作用对响应值的影响，找到最优组合。

 

1、析因设计：

 

考察多个因素（通常2-5个）在两个水平（高、低）下的所有可能组合。

 

可以评估各因素的主效应以及因素间的交互效应。

 

适用于筛选关键因素和识别重要交互作用。

 

随着因素增加，实验次数呈指数增长（2^k，k为因素数）。

 

2、部分析因设计：

 

当因素较多时，为了减少实验次数，只实施全析因设计的一部分（通常是一半或1/4）。

 

牺牲了对高阶交互作用（通常不重要）的评估，保留了主效应和低阶交互效应的评估能力。

 

是高效的因素筛选工具。

 

3、Plackett-Burman 设计：

 

一种特殊的二水平部分析因设计，实验次数是4的倍数（如 12, 20, 24次），远少于全析因设计。

 

主要用于从大量候选因素（N-1个，N为实验次数）中快速筛选出对响应值有显著影响的少数关键因素。

 

不能评估交互作用，只能估计主效应。

 

4、响应面法：

 

在筛选出关键因素后，用于精确寻找这些因素的最优组合，并建立数学模型（通常是二阶多项式方程）。

 

中心复合设计：最常用。在二水平析因设计点基础上，增加中心点和轴向点（星点），使因素可以取三个或更多水平。能有效拟合弯曲的响应曲面。

 

Box-Behnken 设计：另一种常用RSM设计，实验点位于立方体棱的中点，不包含析因设计的角点。实验次数有时比CCD少，且所有点都在安全操作范围内（无极端组合）。不能考察立方体的角点（即因素同时取极端值的情况）。

 

过程：实验设计 -> 进行实验 -> 数据拟合 -> 模型显著性检验 -> 等高线图/响应曲面图分析 -> 寻找最优点（最大值、最小值或特定目标值） -> 验证实验。

 

5、人工神经网络：

 

一种强大的机器学习方法，能处理高度非线性关系。

 

需要大量训练数据，但一旦训练好模型，预测能力可能优于RSM。

 

常用于复杂生物过程的建模和优化。

 

三、其他重要考虑因素和方法

 

1、pH 控制：

 

发酵过程中pH会剧烈变化，显著影响菌体生长和产物合成。

 

在优化培养基时，需要考虑：

 

初始pH的优化。

 

是否添加缓冲盐。

 

在发酵罐中，通常需要流加酸/碱进行自动控制。优化培养基组分本身也能改善pH变化趋势。

 

2、溶氧控制：

 

好氧发酵中，溶氧往往是限制性因素。

 

培养基成分（特别是碳源浓度和类型）影响菌体的摄氧率。

 

优化培养基需考虑其粘度和对氧传递速率的影响。

 

在罐发酵中，通过搅拌转速、通气量、罐压等控制溶氧在适宜水平。

 

3、前体、诱导物和抑制剂：

 

前体：直接掺入到产物分子中的物质。需要优化其添加浓度、添加时间和方式（分批流加），避免毒性。

 

诱导物：诱导目标产物（通常是酶或次级代谢产物）合成的物质（如乳糖诱导β-半乳糖苷酶，麦角固醇诱导某些抗生素）。优化其种类和浓度。

 

抑制剂：有时需要添加特定抑制剂来阻断竞争性代谢途径。

 

4、流加/补料策略优化：

 

对于存在底物抑制（如高浓度葡萄糖抑制）或需要延长生产期的发酵，常采用分批补料发酵。

 

需要优化：

 

流加底物种类（通常是限制性碳源和/或氮源）。

 

流加策略（恒速流加、指数流加、基于反馈控制如溶氧、pH、尾气CO2/O2、在线底物浓度的流加）。

 

流加培养基的浓度和组成。

 

5、培养基成本与经济性：

 

实验室优化的配方可能成本高昂。需要评估：

 

用廉价原料替代昂贵成分（如用糖蜜替代葡萄糖，用玉米浆替代酵母粉）。

 

优化组分浓度，在保证效果的前提下减少用量。

 

考虑原料的稳定性和供应可靠性。

 

6、高内涵筛选/微发酵技术：

 

使用微孔板（24孔、48孔、96孔甚至更高通量）、微流控芯片或小型平行生物反应器系统。

 

允许同时测试成百上千个培养基条件或菌株，大大加速初步筛选和优化过程。

 

结果需要最终在规模放大的生物反应器中进行验证。

 

四、优化流程总结

 

明确目标：最大化产物浓度？最大化产率？最大化得率系数？最小化生产成本？缩短发酵周期？

 

建立分析方法：可靠、快速测定生物量、底物浓度、产物浓度、关键代谢物浓度等。

 

初步实验与单因素：文献调研 -> 确定基础配方 -> 单因素实验确定关键因素范围。

 

筛选关键因素：使用PB设计或其他筛选设计（如部分析因）找出少数几个显著影响目标的关键因素。

 

多因素交互优化：对筛选出的关键因素，使用响应面法进行优化，建立模型，寻找最优区域。

 

验证与放大：在摇瓶和/或小型发酵罐中进行最优条件的验证实验。关键一步！模型预测需要在实验中确认。

 

精细调整与过程控制：在发酵罐中优化pH、溶氧控制策略、流加策略等。

 

成本优化与经济性评估：尝试替代廉价原料，核算成本。

 

重复迭代：优化是一个持续改进的过程，可能需要根据验证和放大结果进行多轮调整。

 

重要提示：

 

无菌操作：所有培养基配制和实验过程必须严格无菌。

 

平行实验：设置重复实验以评估误差。

 

对照：始终设置对照组（通常是原始培养基或基准培养基）。

 

发酵规模：摇瓶优化的结果必须在搅拌通气发酵罐中进行验证和进一步优化，因为传质传热、剪切力、pH/DO控制等条件完全不同。

 

菌种稳定性：优化培养基后，需关注菌种在该培养基上的遗传稳定性。

 

选择哪种或哪些组合的优化方法取决于具体的研究目标、资源（时间、经费、设备）、因素数量以及对交互作用和非线性关系的预期。响应面法是目前最常用和有效的核心优化方法之一。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！