细胞培养中的真菌污染的来源与影响及全面预防策略！

 

百欧博伟生物：细胞培养中遭遇真菌污染，绝对是实验室里令人头疼的问题。那种打开培养箱看到漂浮菌丝的心情，我太理解了——不仅意味着实验中断，还可能损失珍贵的细胞系。下面我来系统梳理真菌污染的来源、影响及实用预防措施：

 

一、来源：真菌孢子无处不在

 

1、环境空气与灰尘：

 

实验室空气中飘浮着大量真菌孢子，尤其在潮湿、通风不良或靠近建筑工地、绿化的环境中。

 

人员走动、开关门、物品移动都会扬起灰尘，携带孢子进入操作区。

 

2、操作人员：

 

皮肤、毛发、衣物：人体是重要的真菌携带源（如皮肤癣菌、酵母菌）。实验服不洁、头发暴露、未戴帽子口罩是常见风险点。

 

呼吸与交谈：说话、咳嗽、打喷嚏会喷出含有微生物（包括真菌孢子）的气溶胶。

 

不当的操作习惯：手或手套触碰非无菌表面（如门把手、电话、显微镜）后再接触培养物品。

 

3、培养箱内部环境：

 

高湿度：为维持细胞生长而设的高湿度环境（>80%）正是真菌生长的温床。

 

水盘污染：培养箱底部用于加湿的水盘若未定期清洁消毒（如使用消毒剂或无菌水），极易滋生霉菌（如青霉、曲霉）和酵母菌。

 

孢子沉积与扩散：污染一旦发生，孢子可随气流在培养箱内扩散，污染其他培养物。

 

4、培养基、试剂与耗材：

 

灭菌不彻底：培养基、胰酶、PBS等液体试剂过滤除菌不完全或保存不当（如开盖时间过长）。

 

水质问题：配制试剂用水（超纯水、蒸馏水）储存系统或管道被污染。

 

血清污染：个别批次胎牛血清可能在采集或处理过程中被真菌污染。

 

耗材灭菌失效：培养瓶/皿、离心管、吸头等灭菌后包装破损或存放过久。

 

5、生物安全柜/超净工作台：

 

表面清洁不彻底：工作台面、内壁、移液器、试剂架等未按要求使用适当消毒剂（如杀孢子剂）彻底擦拭。

 

高效过滤器失效或泄漏：无法有效阻隔外部空气中的孢子。

 

操作气流紊乱：手臂频繁快速进出、物品阻挡风口、身后人员走动等破坏无菌风幕。

 

6、水浴锅：

 

用于预热培养基或试剂的水浴锅是高风险区。温暖的水体是微生物（包括真菌）的理想繁殖地，尤其未定期换水加消毒剂时。

 

7、被污染的细胞系：

 

引入的细胞系本身可能携带潜伏的、未被检测到的真菌污染。

 

交叉污染：处理污染培养物后未彻底清洁即操作其他细胞。

 

二、影响：代价高昂的"不速之客"

 

1、与细胞争夺营养：真菌快速生长消耗培养基中的葡萄糖、氨基酸等关键营养物质，导致细胞"挨饿"。

 

2、改变培养环境：

 

pH值波动：真菌代谢产生酸性或碱性物质，使培养基pH急剧变化。

 

耗竭氧气：大量生长消耗溶解氧，影响细胞呼吸。

 

积累毒素：许多真菌分泌对细胞有毒性的次级代谢产物。

 

3、物理性破坏：

 

菌丝缠绕：霉菌菌丝可缠绕、包裹甚至撕裂细胞。

 

阻塞孔洞：在过滤系统或细小管道中生长造成堵塞。

 

4、抑制细胞生长与导致死亡：上述因素综合作用，最终导致细胞生长停滞、形态异常、活力下降直至大规模死亡。

 

5、实验失败与数据失真：污染培养物无法用于任何可靠的实验（如药物筛选、功能研究、蛋白生产），导致时间、精力、昂贵试剂（如血清、因子）的巨大浪费。

 

6、交叉污染风险：处理不当极易污染同培养箱内其他细胞、实验室环境和设备。

 

7、生物安全隐患：某些真菌（如曲霉）可能对免疫低下人员构成机会性感染风险。

 

三、预防措施：构筑多层防御体系

 

预防永远胜于治疗！构建一套"人-机-料-法-环"的全面防御体系至关重要：

 

1、严格的个人卫生与无菌操作规范：

 

穿戴整齐：进入细胞房必须穿专用清洁实验服、戴一次性帽子（覆盖所有头发）、口罩（遮住口鼻）和手套（进入安全柜前用75%乙醇消毒）。

 

行为规范：尽量减少说话、禁止唱歌/吹口哨，避免快速移动。操作时身体前部尽量少进入安全柜开放区域。

 

手部消毒：进入细胞房前、接触任何培养物品前后，严格洗手并用乙醇消毒。

 

手套管理：进入生物安全柜后，用75%乙醇喷洒手套并待干后再操作。接触潜在污染源（如门把手）后及时更换手套或再次消毒。

 

培训与意识：所有操作人员必须经过严格的无菌操作培训并通过考核。强化污染危害意识。

 

2、实验室环境控制：

 

独立空间：细胞培养实验室应相对独立，限制人员进出。

 

正压与空气过滤：维持细胞房空气正压，安装高效空气过滤器（HEPA），定期更换。

 

清洁消毒：每天用消毒剂清洁地面、台面。每周或每月进行彻底清洁（包括墙面、天花板、设备表面），使用杀孢子剂（如过氧乙酸消毒剂）。保持环境整洁、无尘、无杂物。

 

湿度控制：控制细胞房整体湿度（理想40%-60%），减少环境孢子负荷。

 

3、生物安全柜/超净工作台：

 

认证与维护：定期（通常每年）进行性能认证（风速、气流模式、HEPA完整性）。

 

使用前准备：每次使用前开启风机至少10-15分钟（带UV的可在操作前开启UV照射15-30分钟，但UV不能替代化学消毒！）。用75%乙醇彻底擦拭内表面（台面、侧壁、后壁）、所有放入物品（试剂瓶、移液器、支架）外表面。

 

操作区管理：工作台面只放置本次实验必需物品，分区明确（洁净区、操作区、污物区）。避免阻挡前后风口。移液器、吸头盒等放在两侧靠后位置。

 

废弃物处理：废液缸、废弃枪头/管等及时清理出工作区，避免堆积。工作结束时立即移出所有物品并彻底清洁台面。

 

4、培养箱的维护与监控：

 

水盘管理：

 

首选：使用无菌蒸馏水/超纯水，并加入专用的无挥发性、无腐蚀性、广谱抑菌抑真菌培养箱消毒剂（如铜离子溶液、特定商用消毒剂）。这是最关键措施之一。

 

次选/严格操作：若使用普通水，必须加入适量消毒剂（如硫酸铜终浓度0.1-0.2g/L），并每周彻底更换、严格清洁消毒水盘和内壁。风险较高，不推荐。

 

定期清洁消毒：每月或根据使用频率，彻底清洁消毒培养箱内腔（搁架、内壁、门封条）。取出所有物品后，使用75%乙醇擦拭，必要时使用杀孢子剂。清洁时关闭CO2，避免消毒剂腐蚀。

 

温湿度监控：定期校准温湿度传感器。维持湿度稳定，避免过高（尤其避免冷凝水）。

 

减少开门频率与时间。

 

独立培养箱：有条件可为珍贵或高风险细胞设立专用培养箱。

 

5、培养基、试剂与耗材管理：

 

来源可靠：选择信誉良好的供应商。

 

无菌操作：在安全柜内开瓶、分装试剂。瓶盖开启后朝上放于无菌区域（如用乙醇擦拭过的移液器支架上）。

 

分装使用：大包装试剂分装至小体积无菌管，避免反复冻融主库存或反复取用增加污染风险。

 

规范储存：按说明书要求储存（避光、冷藏/冷冻）。定期检查液体有无浑浊、沉淀。

 

水浴预热：

 

将装有培养基/试剂的瓶子完全密封（旋紧瓶盖，最好用封口膜包裹）后再放入水浴锅。

 

水浴锅水必须定期（最好每天）更换并加入消毒剂（如0.1% 专用水浴锅消毒剂）。

 

取出后立即用75%乙醇彻底擦拭瓶子外表面再放入安全柜。

 

强烈推荐使用干式恒温器替代水浴锅。

 

耗材：使用无菌、一次性耗材。检查包装完整性，过期勿用。灭菌玻璃器皿应彻底清洁干燥，在有效期内使用。

 

6、细胞操作规范：

 

来源清晰：引入新细胞系需进行严格的支原体、真菌、细菌检测。

 

定期检查：每天在显微镜下观察细胞状态，留意培养基是否浑浊、有无菌丝、酵母菌团或异常pH变化。

 

生物安全柜内操作：所有涉及开放培养皿/瓶的操作（传代、换液、加药）必须在生物安全柜内进行。

 

专用移液器与吸头：尽量为不同细胞系配备专用移液器，至少确保吸头不交叉使用。

 

及时处理污染：一旦发现污染，立即将培养物密封（用封口膜或自封袋），移出培养箱和安全柜，按生物危害废物处理规程（高压灭菌）处置。彻底清洁污染区域（培养箱搁架位置、安全柜台面）和接触物品（移液器），使用杀孢子剂。

 

7、避免滥用抗生素：

 

常规细胞培养不应在培养基中添加抗真菌抗生素。其作用有限（对许多霉菌效果差），可能掩盖低水平污染，诱导耐药性，并对某些细胞有毒性。仅在特殊需求（如原代培养初期）且了解风险时短期使用。

 

总结

 

真菌污染是细胞培养实验室的主要威胁之一，其孢子来源广泛且难以彻底消除。污染后果严重，导致资源浪费、实验失败和潜在风险。最有效的策略是建立并严格执行以"预防为主"的多层次防御体系：

 

强化人员培训与无菌意识（最关键）。

 

保证生物安全柜性能良好并正确使用和维护。

 

严格管理和维护培养箱（特别是水盘）。

 

规范操作培养基、试剂和耗材（尤其水浴环节）。

 

保持实验室环境清洁、有序、受控。

 

对新引入细胞系进行检测，对现有细胞定期仔细观察。

 

一旦发现污染，立即、安全、彻底地处置。

 

保持警惕、注重细节并严格遵守操作规程，是最大限度降低真菌污染风险、保障细胞培养实验顺利进行和数据可靠性的根本之道。每次实验前花几分钟做好清洁和准备工作，往往能省下数周甚至数月的重复工作，值得你投入这份耐心！

 

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