微生物限度检测仪的实验前准备与操作规程及注意事项！

 

百欧博伟生物：使用微生物限度检测仪（通常指薄膜过滤法使用的集菌仪或类似设备）进行药品、医疗器械、化妆品、食品等产品的微生物限度检查时，严格遵守操作规程至关重要，以确保检测结果的准确性、可靠性和操作人员的安全。以下是关键的操作规程和注意事项：

 

一、实验前准备

 

1、环境准备:

 

必须在符合要求的洁净环境中进行操作，通常是B级背景下的A级单向流空气区域（如超净工作台或生物安全柜）。

 

提前开启超净台/生物安全柜和室内空调净化系统，运行足够时间（通常≥30分钟）以达到洁净度要求。

 

用适宜的消毒剂对工作台面、设备表面（尤其接触部位）进行彻底擦拭消毒。

 

限制人员进出，减少走动和交谈，避免污染。

 

2、人员准备:

 

穿戴洁净的无菌实验服/连体服、口罩、帽子和无菌手套。必要时佩戴护目镜。

 

用消毒剂对手部进行消毒，并在操作过程中定期消毒或更换手套。

 

所有进入洁净区的物品必须经过消毒处理。

 

3、仪器与耗材准备:

 

仪器检查：检查集菌仪是否运行正常（真空度、蠕动泵转速等），管路是否连接正确、无泄漏、无污染。确认仪器已清洁消毒。

 

耗材灭菌：

 

滤杯/滤头：必须经过有效的灭菌处理（如湿热灭菌121 15分钟）。使用时确保在无菌状态下打开包装。

 

滤膜：选择孔径0.45µm（或标准规定）的适宜材质（如混合纤维素酯）滤膜，必须无菌。使用时用无菌镊子夹取，避免触碰滤膜中央过滤区域。

 

培养皿：准备无菌的塑料或玻璃培养皿（用于放置滤膜）。

 

培养基：准备足量、无菌的胰酪大豆胨液体培养基和沙氏葡萄糖液体培养基（或其他规定培养基），并确保其适用性检查合格。

 

冲洗液：准备足量、无菌的稀释液或冲洗液（如0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液）。

 

其他：无菌镊子、无菌剪刀、无菌注射器、无菌样品容器、消毒剂、记号笔等。

 

4、样品准备:

 

按照标准操作规程接收、登记和储存样品。

 

在洁净环境下，使用无菌工具和方法对样品进行无菌处理（如消毒包装表面、无菌开启、无菌称量或量取）。

 

根据产品特性和标准规定，将样品溶解或稀释到适宜的浓度（通常使微生物负荷在可计数范围内）。

 

二、操作过程

 

1、组装无菌过滤装置:

 

在超净台/生物安全柜内，进行无菌操作。

 

打开无菌滤杯/滤头的包装。

 

用无菌镊子小心取出一张无菌滤膜，有网格面向上（利于菌落观察计数），放置在滤杯底座的支撑筛板上。确保滤膜平整无皱褶。

 

将滤杯上盖（或漏斗部分）对准底座旋紧或卡紧，确保密封。整个过滤装置组装过程应快速、无菌。

 

2、连接仪器:

 

将组装好的无菌滤杯连接到集菌仪的抽滤接口上。

 

将滤杯的排液管出口端放入废液收集瓶中（废液瓶内应有消毒液）。

 

将冲洗液瓶通过无菌管路连接到滤杯的进液口（如果是蠕动泵进液模式）。

 

确保所有连接紧密无泄漏。

 

3、样品过滤:

 

用无菌注射器吸取规定体积的样品溶液（或样品稀释液）。

 

将注射器连接到滤杯的样品注入口（如有），或打开进液口盖，将样品溶液无菌转移到滤杯中。

 

启动集菌仪，施加适当的负压或启动蠕动泵，使样品溶液通过滤膜。控制流速，避免过快导致微生物截留不完全或滤膜破损。

 

样品溶液完全通过滤膜后，停止抽滤/泵。

 

4、冲洗滤膜:

 

此步骤至关重要，目的是洗去滤膜上可能残留的抑菌成分。

 

用无菌注射器或通过冲洗液管路，向滤杯中加入规定体积（通常每次100ml）的无菌冲洗液。

 

启动仪器，使冲洗液通过滤膜。重复冲洗操作规定的次数（通常3次 x 100ml，或根据验证结果确定）。每次冲洗应让冲洗液完全流干。

 

注意：冲洗液体积和次数必须经过方法适用性验证确认，确保能有效消除产品的抑菌性。

 

5、过滤阳性对照/供试品对照（如适用）:

 

按标准规定，同时操作阳性对照（加入已知少量菌的样品溶液）和供试品对照（仅过滤冲洗液，检查无菌操作和冲洗液无菌性）。

 

6、转移滤膜:

 

过滤和冲洗完成后，关闭真空或停止泵。

 

小心地拆卸滤杯，避免触碰滤膜。

 

用无菌镊子轻轻夹起滤膜的边缘，将其从底座上取下。

 

将滤膜有菌面向上（即过滤时朝上的网格面），平整地贴放在预先准备好的无菌培养皿中预先倾倒好的固体培养基表面（如营养琼脂用于需氧菌总数，沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数）。确保滤膜与培养基之间无气泡。

 

注意：此步骤操作要快且准，避免环境微生物污染滤膜。

 

7、培养:

 

将贴有滤膜的培养皿倒置（防止冷凝水滴落影响菌落生长）。

 

放入规定温度的培养箱中培养：

 

需氧菌总数 (TAMC)：通常贴于营养琼脂培养基，30-35培养不少于3天（通常3-5天）。

 

霉菌和酵母菌总数 (TYMC)：通常贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，20-25培养不少于5天（通常5-7天）。

 

培养时间需根据验证结果和标准规定执行。

 

8、过滤下一个样品:

 

如需检测多个样品，必须更换整套无菌过滤装置（滤杯/滤头、滤膜）和连接管路（或彻底消毒），避免交叉污染。

 

对设备接触过样品的部分（如滤杯接口）进行消毒（如用75%乙醇擦拭）。

 

三、操作后处理

 

1、仪器清洁与消毒:

 

实验结束后，立即对集菌仪表面进行清洁消毒。

 

对接触过样品的部件（如滤杯接口、可能接触样品的管路）进行彻底清洁和消毒。可拆卸部件应按SOP进行清洗和湿热灭菌。不可拆卸管路需用适宜消毒剂充分冲洗，再用注射用水或纯化水冲洗干净，最后用75%乙醇冲洗并干燥（具体方法依据设备说明书和验证结果）。

 

排空并清洁消毒废液瓶。

 

2、废物处理:

 

使用过的滤杯、滤膜、培养基、培养皿、样品容器、一次性耗材等，均视为生物废弃物。

 

必须放入专用的、防渗漏的生物危害废物袋/容器中。

 

按照实验室生物安全规定和废弃物处理SOP进行高压蒸汽灭菌（121, 30分钟以上）或化学消毒后，再交由有资质的机构处理。严禁随意丢弃！

 

3、环境清洁:

 

清洁消毒工作台面、地面及其他可能污染的区域。

 

记录清洁消毒情况。

 

四、记录与报告

 

1、详细记录：操作全过程的关键信息，包括：

 

日期、时间、操作人员。

 

使用的仪器名称、编号、状态。

 

样品信息（名称、批号、规格）。

 

样品处理过程（稀释方法、体积）。

 

使用的滤膜批号、培养基批号及适用性检查结果。

 

过滤体积、冲洗液种类、体积及次数。

 

培养条件（培养基类型、培养温度、开始培养时间）。

 

培养结果观察记录（菌落计数、形态描述）。

 

实验过程中出现的任何偏差或异常情况。

 

清洁消毒记录。

 

2、结果计算与报告：根据菌落计数结果，按照规定方法计算每单位样品（如每克、每毫升、每件）的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数，出具检测报告。结果报告应符合相关法规和标准的要求。

 

五、关键注意事项与安全

 

无菌操作是核心：整个操作过程必须贯穿严格的无菌观念，所有接触样品、滤膜、培养基、培养皿的步骤都必须在A级洁净区进行，并使用无菌器具。

 

生物安全防护：微生物限度检测涉及潜在病原微生物。操作者必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），严格遵守实验室生物安全规定。处理废弃物时尤其要小心。

 

方法验证：薄膜过滤法必须经过方法适用性验证，确认供试品在该方法下无抑菌作用或抑菌作用可被有效消除（通过冲洗），且验证所用的冲洗液体积和冲洗次数适用于日常检测。未经验证的方法结果不可靠。

 

防止交叉污染：不同样品之间必须彻底清洁消毒设备接触面或更换耗材。阳性对照操作要特别小心，防止污染环境和其他样品。

 

滤膜完整性：操作中注意控制负压/流速，防止滤膜破损。过滤后检查滤膜是否完好。

 

设备校准与维护：定期对集菌仪（真空度、泵速等）、培养箱（温度）进行校准和维护，确保其性能可靠。

 

遵守SOP：严格执行实验室制定的标准操作规程（SOP）、药典或相关产品标准的规定。

 

牢记：微生物限度检测结果的可靠性直接关系到产品的安全性评价。任何操作上的疏忽都可能导致假阴性或假阳性结果，因此必须严谨、细致、规范地执行每一步操作规程。操作前务必仔细阅读设备说明书和实验室的相关SOP，并接受充分的培训。

 

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