细胞培养方法之传代培养操作步骤与实验技巧及注意事项！

 

百欧博伟生物：细胞培养是生物医学研究中最基础也是最重要的实验技术之一。它涉及在体外模拟体内环境，使细胞在人工条件下生长、增殖和维持。传代培养是当细胞在培养容器中生长至一定密度时，将其分瓶接种，以提供更多生长空间并维持细胞活性的过程。

 

一、细胞培养基本要素与方法

 

1、无菌环境：

 

生物安全柜 (BSC)：所有开放操作必须在经认证的BSC中进行，提供无菌工作区并保护操作者和环境。

 

无菌技术：严格遵循无菌操作规程：穿戴实验服、手套、口罩；试剂、耗材灭菌；避免开口暴露过久；勤用75%酒精消毒手、台面和物品表面；使用无菌枪头、移液管。

 

培养基和试剂：必须无菌（通常购买已灭菌产品或自行过滤除菌）。

 

2、培养环境模拟：

 

温度：绝大多数哺乳动物细胞在 37°C 下培养。

 

气体环境：大多数细胞需要 5% CO 来维持培养基的pH值（通常在7.2-7.4）。使用带有CO控制的恒温培养箱。

 

湿度：培养箱需维持高湿度（>95%），防止培养基蒸发。通常使用无菌水盘。

 

培养基：

 

基础培养基：提供基本营养物质（氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖）。

 

血清：最常用的是胎牛血清，提供生长因子、激素、粘附因子和营养物质。浓度通常为5-20%。

 

添加剂：抗生素（如链霉素）和抗真菌剂（如两性霉素B或制霉菌素）用于防止污染（但无法替代无菌操作）；有时需添加L-谷氨酰胺（细胞重要能量来源，不稳定，需定期补充）、非必需氨基酸、HEPES缓冲液（pH稳定）等。

 

培养容器：根据不同需求选择：培养瓶（T25, T75, T175）、培养皿（35mm, 60mm, 100mm）、多孔板（6孔，12孔，24孔，96孔等）。材质通常是经表面处理的聚苯乙烯塑料，利于细胞贴附。

 

3、细胞类型：

 

贴壁细胞：需要附着在固体表面生长。传代时需用酶（如胰蛋白酶）消化使其从培养皿/瓶底脱落。

 

悬浮细胞：在培养基中自由漂浮生长。传代时直接稀释或离心收集即可。

 

二、贴壁细胞传代培养操作步骤（以常用胰蛋白酶消化法为例）

 

（一）准备工作：

 

1、预热：将所需体积的完全培养基（含血清）、PBS（磷酸盐缓冲液，无钙镁）、胰蛋白酶-EDTA溶液置于37°C水浴或培养箱中预热15-30分钟。冷的溶液会降低消化效率并刺激细胞。

 

2、生物安全柜准备：开启BSC通风和紫外灯至少15-30分钟。关闭紫外灯，开启照明和风机。用75%酒精彻底擦拭内表面。准备好无菌移液器、枪头、废液缸、离心管、新培养瓶/皿、标记笔。

 

3、观察细胞：将原培养瓶/皿从培养箱取出，在倒置显微镜下观察细胞状态和密度。细胞应处于对数生长期后期（融合度约80-90%），形态健康，无污染迹象（浑浊、漂浮物、菌丝、异常pH变化）。这是传代的最佳时机。

 

（二）操作步骤：

 

1、移除旧培养基：

 

小心地将含有旧培养基的培养瓶/皿转移到BSC内。

 

用无菌移液管或真空泵（带无菌吸头）轻柔地吸弃旧培养基。避免触及瓶底细胞层。

 

2、PBS洗涤：

 

向培养瓶/皿中加入适量预热的无菌PBS（体积通常能覆盖细胞层即可，如T25瓶约3-5ml）。

 

轻轻晃动或倾斜容器，使PBS润洗整个细胞生长面。

 

吸弃PBS。此步骤旨在去除残留的血清（血清含有胰蛋白酶抑制剂），并洗去死细胞碎片。

 

3、加入胰蛋白酶-EDTA：

 

加入适量预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（覆盖细胞层即可，如T25瓶约1-2ml）。确保溶液均匀覆盖细胞。

 

轻轻晃动容器，使溶液均匀分布。

 

消化：将培养瓶/皿放回37°C培养箱中，或置于BSC内室温下（37°C效果更快更均匀）。消化时间需密切观察（通常30秒-5分钟，取决于细胞类型和胰酶活性），切勿过度消化。

 

观察判断：显微镜下观察或肉眼倾斜观察。当大部分细胞变圆、边缘发亮、有脱落趋势（轻拍瓶壁可见“沙雾”状脱落）时，立即终止消化。切勿等到所有细胞完全脱落！

 

4、终止消化：

 

迅速将培养瓶/皿移回BSC。

 

加入含血清的完全培养基（体积通常是胰酶体积的2-5倍，如T25瓶加入4-8ml）。血清中的抑制剂能快速中和胰蛋白酶活性。

 

用移液管轻柔吹打细胞层表面（沿瓶壁或皿底不同方向反复吹吸数次），使贴壁细胞完全脱离并分散成单细胞悬液。吹打动作要轻柔，避免产生过多气泡损伤细胞。

 

5、收集细胞悬液：

 

将含有细胞的培养基（即细胞悬液）转移至一个无菌的离心管中。

 

6、离心：

 

平衡离心管后，放入离心机。

 

以相对较低的转速离心（通常1000-1200 rpm / 约150-200 g）5-10分钟。目的是将细胞沉淀下来，去除含有胰酶和旧培养基的上清液。

 

7、重悬细胞：

 

离心结束后，小心取出离心管，避免扰动沉淀。

 

用无菌移液管彻底吸弃上清液。

 

加入新鲜预热的完全培养基（体积根据后续分瓶需求确定）。

 

用移液管轻柔吹打或反复抽吸（避免气泡），使细胞沉淀完全、均匀地重悬成单细胞悬液。吹打次数不宜过多过猛。

 

8、细胞计数与活力检测 (可选但推荐)：

 

取少量细胞悬液，用台盼蓝染色法或自动细胞计数仪进行计数，并计算细胞活力（活细胞百分比）。

 

根据计数结果调整最终接种密度。

 

9、分瓶接种：

 

根据实验需求（扩增或维持）和细胞类型，将计算好体积的细胞悬液加入新的、标记好信息（细胞名称、代次、日期、操作者）的培养瓶/皿中。

 

加入新鲜预热的完全培养基至所需工作体积（如T25瓶通常8-10ml）。

 

轻柔晃动或十字法（前后左右）晃动容器，使细胞均匀分布。

 

10、培养：

 

盖紧瓶盖或盖上皿盖。

 

将新接种的培养瓶/皿小心放入37°C，5% CO，饱和湿度的恒温培养箱中。

 

通常24小时后观察细胞贴壁和生长情况。

 

三、悬浮细胞传代培养操作步骤

 

悬浮细胞传代相对简单，无需消化步骤：

 

观察细胞：同贴壁细胞。

 

收集细胞：将培养瓶/皿中的细胞悬液轻轻混匀，转移至无菌离心管中。

 

离心：同贴壁细胞（1000-1200 rpm，5-10分钟）。

 

移除上清：吸弃含有旧培养基的上清液。

 

重悬：加入适量新鲜预热的完全培养基，轻柔吹打重悬细胞。

 

计数与活力检测 (可选但推荐)： 同贴壁细胞。

 

分瓶接种：根据计数结果，将所需体积的细胞悬液加入新的、标记好的培养容器中，补加新鲜培养基至工作体积。

 

培养：同贴壁细胞。

 

关键注意事项：

 

无菌！无菌！无菌！这是细胞培养成功的首要前提。任何疏忽都可能导致污染（细菌、真菌、支原体），导致实验失败。

 

轻柔操作：吹打、离心、移液等动作务必轻柔，避免机械损伤细胞。

 

严格控制消化时间：过度消化会严重损伤细胞。

 

环境稳定：确保培养箱温度、CO浓度、湿度恒定。频繁开关门会影响稳定性。

 

定期观察：每天或隔天观察细胞形态、密度、培养基颜色（pH指示）及有无污染迹象。

 

及时传代：细胞过密（100%融合或悬浮细胞密度过高）会导致接触抑制、营养耗竭、代谢废物积累，影响细胞状态甚至死亡。不要在细胞长满后才传代。

 

记录：详细记录细胞名称、来源、代数、传代日期、操作步骤、培养基批次、任何异常情况等。这对实验可重复性和问题追踪至关重要。

 

选择合适的传代比例/密度：根据细胞生长速度和实验目的决定分瓶比例（如1:2, 1:3, 1:4, 1:10）或接种密度（如细胞数/cm² 或 细胞数/ml）。

 

血清批次：不同批次的血清质量可能有差异。对于关键实验，建议测试不同批次血清或使用同一批次血清。

 

定期检测支原体：支原体污染非常普遍且难以察觉，会严重影响实验结果。建议定期（如每1-2个月）进行支原体检测。

 

实验技巧：

 

预热充分：确保所有接触细胞的液体都预热至37°C。

 

胰酶浓度与时间：摸索适合自己细胞系的最佳胰酶浓度和消化时间。有些细胞可能需要更低浓度或更短时间。

 

吹打技巧：吹打时枪头抵住瓶壁或管壁，避免直接冲击细胞沉淀。吹吸力度适中，次数以细胞分散均匀为准。

 

避免气泡：剧烈吹打或移液容易产生气泡，损伤细胞。

 

细胞计数：台盼蓝染色时，活细胞排斥染料不着色（透明），死细胞着蓝色。计数应在染色后几分钟内完成。

 

冻存备份：定期冻存低代数的健康细胞作为备份，防止因污染或意外丢失细胞株。

 

掌握细胞培养和传代技术需要理论学习和大量的实践操作。严格按照规程操作，注意细节，保持耐心和细心，是成功的关键。

 

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