铜绿假单胞菌的保存温度问题及操作方法与注意事项！

 

铜绿假单胞菌是一种对环境适应力较强的革兰氏阴性杆菌，其保存温度取决于保存的目的和期限。

 

以下是不同保存方法推荐的核心温度：

 

一、短期保存 (数天至1个月)：

 

温度：4°C

 

方法：在营养琼脂斜面或平板上生长后，置于4°C冰箱。

 

注意事项：

 

这是最常用的短期工作菌株保存方法。

 

保存时间通常不超过1个月。超过这个时间，细菌活力会明显下降，可能出现变异或死亡。

 

需要定期（一般每月一次）转接到新鲜培养基上传代保存。

 

平板应密封以防干燥。斜面塞紧塞子或用封口膜封口。

 

二、中期保存 (1-6个月)：

 

温度：4°C

 

方法：半固体琼脂穿刺保存法。

 

使用含0.5%-0.7%琼脂的营养半固体培养基（如营养肉汤加琼脂）。

 

用接种针穿刺接种到培养基深部。

 

培养生长后，拧紧管盖或用Parafilm密封，直立放置于4°C冰箱。

 

优点：比普通斜面保存时间长，可达3-6个月，操作相对简单。

 

注意事项：仍需注意密封防干燥。

 

三、长期保存 (6个月至数年甚至更久)：

 

温度：-70°C 至 -80°C (首选) 或 液氮气相 (-150°C 至 -196°C)

 

方法：

 

超低温冷冻保存：这是最常用、最可靠的长期保存方法。

 

将生长旺盛的菌悬液（通常用对数生长期的菌体）与冷冻保护剂（如15%-25% (v/v) 甘油或5%-10% (v/v) DMSO）混合均匀。

 

分装到无菌的冷冻保存管中。

 

快速冷冻：将冻存管直接放入-70°C 或 -80°C 超低温冰箱，或先在干冰/异丙醇浴（约-70°C）中预冷数小时，再转入超低温冰箱。避免使用普通 -20°C 冰箱进行长期保存，因为该温度下冰晶形成会造成细胞损伤，菌株存活率会随时间急剧下降。

 

复苏：需要时，快速取出冻存管（避免在室温下长时间停留），立即置于37°C - 40°C 水浴中快速振荡融化，然后尽快接种到合适的培养基上。

 

冷冻干燥 (冻干) 保存：

 

将菌悬液（通常加有保护剂如脱脂牛奶、蔗糖等）分装到安瓿瓶中，在冷冻干燥机中进行冷冻和真空干燥。

 

冻干完成后，在真空或充惰性气体（如氮气）条件下密封安瓿瓶。

 

保存于4°C 或 -20°C 暗处。

 

优点：保存期极长（可达数十年），便于运输，菌种稳定性好。

 

缺点：操作复杂，需要专用设备，复苏时操作要求较高。

 

注意事项：

 

-70°C / -80°C 优于 -20°C：普通家用或实验室的 -20°C 冰箱不适合长期保存微生物（包括铜绿假单胞菌），因为此温度下冰晶持续生长，会严重损伤细胞膜和结构，导致存活率低且不稳定。必须使用超低温冰箱 (-70°C 或更低) 或液氮。

 

保护剂至关重要：甘油或DMSO能降低冰点，减少冰晶形成，保护细胞。

 

快速冷冻和快速复苏：尽量减少冰晶对细胞的伤害。

 

避免反复冻融：每次复苏后应使用新的冻存管，避免反复冻融同一管菌液，这会极大降低存活率。

 

总结与建议：

 

日常短期使用 (1个月内)：4°C 斜面或平板保存，定期传代。

 

中期保存 (几个月)：4°C 半固体琼脂穿刺保存。

 

长期稳定保存 (6个月以上)：首选 -70°C / -80°C 超低温冷冻保存（加15-25%甘油或5-10% ）。绝对避免使用 -20°C 进行长期保存。

 

超长期或菌种库保存：冷冻干燥保存 (4°C 或 -20°C)。

 

选择哪种方法取决于您的具体需求：

 

如果只是需要经常使用的菌株，4°C斜面保存最方便。

 

如果需要保存几个月且不想频繁传代，半固体穿刺法是个折中选择。

 

如果需要保存菌株作为重要资源、备用或长期研究，-70°C / -80°C 冷冻保存是最可靠、最推荐的标准方法。

 

重要提示：

 

标记清晰：无论哪种方法，务必清楚标记菌株名称、保存日期、保存方法（如甘油浓度）和传代次数。

 

复苏后验证：长期保存后复苏的菌株，建议进行关键特性（如形态、生化特性、药敏谱等）的验证，确保没有发生变异。

 

菌株差异：虽然铜绿假单胞菌总体耐受力较强，但不同菌株对冷冻保存的敏感性可能略有差异。对于特别重要的菌株，可先小规模测试保存效果。

 

参考标准流程：实验室应建立标准的菌种保存操作规程 (SOP)。参考权威菌种保藏中心提供的针对特定菌株的保存建议也是很好的做法。

 

总之，对于铜绿假单胞菌的长期保存，-70°C / -80°C 超低温冷冻加甘油保护剂是最常用、最可靠的方法。

 

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