乳酸杆菌选择性琼脂的原理与使用方法及注意事项！

 

乳酸杆菌选择性琼脂是一种专门设计用于从复杂样本（如食品、饮料、临床标本、环境样本）中分离和初步鉴定乳酸杆菌的固体培养基。其核心在于“选择性”和“指示性”。

 

一、原理

 

1、选择性原理 (抑制非目标菌)：

 

低 pH 环境：培养基通常调整至较低的初始 pH（约 5.4 - 5.6）。这个酸性环境不利于大多数非乳酸杆菌的细菌（尤其是许多革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌）生长，而乳酸杆菌本身耐酸甚至嗜酸，能在此环境下良好生长。

 

抗生素 (常见配方)：许多商业化的乳酸杆菌选择性琼脂会添加万古霉素（或其他针对革兰氏阳性菌的抗生素）。万古霉素能有效抑制绝大多数革兰氏阳性菌（如葡萄球菌、链球菌、肠球菌、芽孢杆菌等），但乳酸杆菌（特别是乳杆菌属）通常对其具有天然抗性。这极大地提高了对乳酸杆菌的选择性。

 

其他抑制剂 (可选)：有些配方可能添加其他抑制剂，如抗真菌剂来抑制酵母和霉菌的生长。

 

2、指示性原理 (初步鉴定乳酸杆菌)：

 

pH 指示剂：培养基中含有溴甲酚紫。这是一种 pH 指示剂，变色范围大约在 pH 5.2 (黄色) 到 pH 6.8 (紫色) 之间。

 

产酸反应：乳酸杆菌的主要特征之一是发酵碳水化合物产生大量乳酸等有机酸。当目标乳酸杆菌在培养基上生长并代谢其中的糖类（通常是葡萄糖）时，会产生酸性代谢产物。

 

颜色变化：产生的酸导致培养基局部 pH 值显著下降，使得溴甲酚紫指示剂从紫色（中性/弱碱性）变为黄色（酸性）。因此，在菌落周围会出现一个明显的黄色晕圈。这个黄色晕圈是初步鉴定为乳酸杆菌的重要视觉指标。

 

缓冲盐与碳酸钙 (可选)：有些配方添加：

 

缓冲盐：帮助维持一定的缓冲能力，防止培养基过快酸化而抑制乳酸杆菌自身生长。

 

碳酸钙 (CaCO)：悬浮在琼脂中，呈不透明的白色沉淀。乳酸杆菌产生的酸会溶解其周围的碳酸钙，在黄色菌落周围形成透明的水解圈。这提供了另一个直观的产酸证据（但并非所有配方都含碳酸钙）。

 

3、营养基础：

 

提供适合乳酸杆菌生长的基本营养成分，如蛋白胨、酵母提取物等。

 

常含有番茄汁或番茄浸粉：番茄汁富含乳酸杆菌生长所需的维生素、氨基酸和其他生长因子，能显著促进其生长，并增强其产生典型菌落特征的能力。这是区分不同种类乳酸杆菌选择性琼脂的一个重要特征。

 

二、使用方法

 

1、培养基准备：

 

根据制造商说明书称取适量的脱水培养基粉末。

 

加入规定体积的蒸馏水或去离子水。

 

加热溶解并煮沸：充分搅拌并加热至完全溶解，通常需要短暂煮沸。

 

灭菌：121°C (15 psi) 高压蒸汽灭菌 15 分钟。 灭菌后培养基应为均匀的紫色（含溴甲酚紫）。

 

冷却：将灭菌后的培养基冷却至约 45-50°C（手感温热但不烫手）。

 

添加抗生素 (如果需要)：如果购买的培养基粉末不含抗生素，或需要额外添加特定抗生素（如万古霉素），需在培养基冷却至合适温度后，无菌操作加入无菌过滤除菌的抗生素溶液，并轻轻混匀（避免产生气泡）。

 

倒平板：在无菌条件下，将培养基倒入无菌培养皿中（约 15-20 ml/90mm 平皿）。让培养基在水平台面上凝固。凝固后应为均匀的紫色（含溴甲酚紫）或不透明（含碳酸钙）。

 

2、样品处理：

 

根据样本类型（食品、饮料、粪便、发酵液等）进行适当的均质化（如使用均质袋、匀浆器）。

 

制备系列稀释液（通常用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液），以获得适合计数的菌落数（目标 30-300 CFU/平板）。

 

3、接种：

 

涂布法 (最常用)：取适量（通常是 0.1 ml）的样品原液或适当稀释度的稀释液，滴加到凝固的琼脂平板中央。

 

用无菌的 L 形玻璃棒或一次性涂布棒，将液体均匀涂布在整个平板表面。确保液体被琼脂吸收。

 

倾注法 (可选，较少用)：取 1 ml 样品稀释液加入无菌培养皿中，再倾入约 15 ml 冷却至约 45°C 的琼脂培养基，立即混匀，静置凝固。

 

4、培养：

 

温度：通常推荐在 30-37°C 下培养。具体温度可能根据目标乳酸杆菌种类调整（如嗜热链球菌可能需要 42-45°C）。

 

气氛：厌氧或微需氧环境对于许多乳酸杆菌（尤其是乳杆菌属）的旺盛生长至关重要。常用方法：

 

厌氧罐/袋：使用厌氧产气袋或抽气换气系统（通入 N/CO/H 混合气）创造厌氧环境。

 

蜡烛罐：提供一个微需氧环境（约 3-5% CO），对某些兼性厌氧的乳酸杆菌也有效。

 

(注意：在普通有氧条件下培养，乳酸杆菌可能生长缓慢、菌落变小或不产酸晕，导致低估或漏检）。

 

时间：通常培养 48-72 小时。有些生长缓慢的菌株可能需要更长的时间（最多 5 天）。定期观察。

 

5、结果判读：

 

典型乳酸杆菌菌落：

 

菌落通常较小（1-3 mm）、圆形、凸起、光滑、不透明（奶油色、白色或米黄色）。

 

最关键的特征：菌落周围有一个明显的黄色晕圈（产酸区）。 这是初步鉴定为乳酸杆菌的主要依据。

 

(含碳酸钙的配方)：在黄色晕圈内，菌落周围可能还有一个清晰的透明圈（碳酸钙被溶解的区域）。

 

计数：计数具有典型形态（特别是带有清晰黄色晕圈）的菌落，乘以稀释倍数，报告为样品中乳酸杆菌的数量（CFU/g 或 CFU/ml）。

 

非目标菌：非乳酸杆菌的细菌通常被抑制（不生长或生长极差）。如果生长，其菌落周围通常没有黄色晕圈（保持紫色或仅轻微变色）。

 

三、重要注意事项

 

选择性非绝对：

 

培养基的选择性并非 100%。极少数非乳酸杆菌的耐酸菌或对所用抗生素有抗性的菌（如某些肠球菌）也可能生长，甚至偶尔产酸（假阳性）。

 

并非所有乳酸杆菌都能在特定配方上生长良好或产生典型晕圈（假阴性）。不同属/种的乳酸杆菌对生长条件（温度、厌氧程度、营养需求）的偏好不同。

 

初步鉴定：乳酸杆菌选择性琼脂上的典型菌落只能作为乳酸杆菌存在的初步指示。必须通过进一步的生化试验、显微镜形态观察（革兰氏阳性杆菌/球菌、无芽孢）或分子生物学方法来确认鉴定到属或种的水平。

 

培养条件至关重要：提供合适的厌氧/微需氧环境对获得可靠结果极为重要。

 

配方差异：不同厂商或不同名称的乳酸杆菌选择性琼脂在具体成分（番茄汁含量、缓冲体系、是否含碳酸钙、抗生素种类）上可能有差异。务必遵循所用特定产品的说明书进行操作和结果解释。

 

质控：建议使用已知的标准乳酸杆菌菌株（阳性对照）和非乳酸杆菌菌株（阴性对照）进行质控，验证培养基的选择性和指示性能。

 

样品复杂性：对于含有大量竞争菌或抑制物的复杂样品（如粪便、某些发酵食品），可能需要更高的稀释度或额外的样品预处理步骤。

 

存储：制备好的平板应储存在 2-8°C（避光），并在保质期内使用。使用前恢复至室温。

 

总结：乳酸杆菌选择性琼脂通过低 pH 和/或抗生素抑制非目标菌，利用溴甲酚紫（和/或碳酸钙）指示产酸能力，并结合番茄汁等营养成分，实现对乳酸杆菌的选择性分离和初步鉴定。正确的样品处理、接种、以及关键性的厌氧/微需氧培养条件是获得准确可靠结果的基础。阳性结果需经确认试验证实。

 

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