组织和细胞蛋白提取及定量的常规流程与操作步骤！

 

一、组织样本蛋白提取

 

1、实验前准备

 

试剂：预冷的裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液（PBS）、液氮。

 

仪器：匀浆器/研磨仪、低温离心机、冰盒、涡旋仪。

 

样本处理：新鲜组织迅速用液氮速冻，保存于-80或立即处理。

 

2、操作步骤

 

组织解冻与称量

 

取50-100 mg组织，剪碎后置于预冷研钵中，加入液氮快速研磨成粉末。

 

裂解

 

加入1 mL裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟，间歇涡旋混匀。

 

匀浆

 

使用超声破碎仪或组织匀浆器进一步破碎组织（冰上操作，避免产热）。

 

离心

 

4、12,000 ×g 离心15分钟，取上清（含可溶性蛋白）。

 

分装保存

 

分装后-80保存，避免反复冻融。

 

二、细胞样本蛋白提取

 

1、实验前准备

 

试剂：预冷裂解液（RIPA）、蛋白酶抑制剂、PBS（含EDTA）、胰酶（贴壁细胞）。

 

仪器：细胞刮、离心管、低温离心机。

 

2、操作步骤

 

细胞收集

 

贴壁细胞：PBS洗涤后刮取或用胰酶消化（终止后离心收集）。

 

悬浮细胞：直接离心（1,000 ×g，5分钟）收集。

 

裂解

 

每1×10细胞加入100-200 μL裂解液（含抑制剂），冰上裂解30分钟，间歇涡旋。

 

离心

 

4、12,000 ×g 离心15分钟，取上清。

 

保存

 

分装后-80保存。

 

三、蛋白定量

 

1、试剂与仪器

 

试剂：BCA试剂盒（含标准品BSA）、PBS或裂解液。

 

仪器：酶标仪、96孔板、微量移液器。

 

2、操作步骤

 

标准曲线制备

 

用BSA标准品（0.2-2 mg/mL）按梯度稀释（如0、0.2、0.5、1、1.5、2 mg/mL）。

 

样品稀释

 

将待测蛋白样品用PBS或裂解液稀释至标准曲线范围内（通常稀释5-10倍）。

 

反应体系

 

每孔加入25 μL标准品/样品 + 200 μL BCA工作液，37孵育30分钟。

 

检测吸光度

 

用酶标仪测定562 nm处吸光度（OD值）。

 

计算浓度

 

根据标准曲线计算样品浓度，公式：

 

蛋白浓度（μg/μL）=（稀释后浓度 × 稀释倍数） / 1000

 

四、注意事项

 

低温操作：全程冰上操作，避免蛋白降解。

 

抑制剂使用：裂解液中需添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂（根据实验需求）。

 

避免污染：使用无核酸酶/蛋白酶污染的离心管。

 

线性范围：确保样品OD值在标准曲线线性范围内。

 

样本保存：长期保存分装于-80，短期（1周）可存于-20。

 

五、常见问题

 

低浓度：增加样本量或减少裂解液体积。

 

高背景：离心后取上清避免吸入沉淀。

 

数据偏差：重复测定3次取平均值。

 

通过上述流程可获得高纯度蛋白样本并准确测定浓度，为下游实验奠定基础。

 

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