四环素检定琼脂的原理与使用方法及注意事项与应用场景！

 

一、原理

 

四环素检定琼脂是一种选择性培养基，用于检测微生物对四环素的敏感性或筛选携带四环素抗性基因的菌株（如重组质粒转化后的细菌）。其核心原理如下：

 

1、抗生素作用机制：

 

四环素通过结合细菌核糖体30S亚基，抑制蛋白质合成，导致敏感菌死亡。

 

2、抗性机制：

 

携带抗性基因的细菌能表达外排泵蛋白或修饰酶，主动排出四环素或使其失活，从而在含四环素的培养基中存活。

 

3、培养基成分：

 

基础营养（蛋白胨、酵母提取物等）支持细菌生长。

 

四环素（终浓度通常为10–50 μg/mL）作为选择性压力。

 

琼脂提供固体基质（注意：四环素需在培养基灭菌后冷却至约50时加入，避免高温失活）。

 

二、使用方法

 

1、培养基配制

 

步骤：

 

a.称取适量四环素检定琼脂干粉，按说明书加入蒸馏水。

 

b.加热溶解并高压灭菌（121, 15分钟）。

 

c.冷却至50左右，无菌条件下加入过滤除菌的四环素溶液（终浓度需精确）。

 

d.混匀后倒入无菌培养皿，凝固后备用。

 

2、接种与培养

 

样品处理：将待测菌液稀释至适当浓度（如10 CFU/mL）。

 

接种方法：

 

涂布法：取100 μL菌液均匀涂布于琼脂表面。

 

划线法：用接种环分区划线分离单菌落。

 

培养条件：倒置平板，37恒温培养16–24小时（根据菌种调整时间）。

 

3、结果判读

 

敏感菌：无可见菌落生长（四环素抑制其繁殖）。

 

抗性菌：形成清晰菌落（携带抗性基因，可在含四环素环境中增殖）。

 

三、注意事项

 

1、四环素特性：

 

对光和热敏感，需避光保存，并在培养基冷却后加入。

 

避免反复冻融，以防降解失效。

 

2、浓度控制：

 

过高浓度可能抑制部分抗性菌，过低则无法筛选敏感菌。

 

推荐使用前验证最佳浓度。

 

3、无菌操作：

 

添加四环素时需严格无菌，防止污染。

 

4、质控菌株：

 

建议同步接种已知敏感菌（如大肠杆菌ATCC 25922）和抗性菌作为对照。

 

四、应用场景

 

分子克隆中筛选含四环素抗性标记的重组质粒。

 

临床微生物实验室测定病原菌对四环素的敏感性。

 

环境样本中抗性菌的监测与研究。

 

通过以上步骤，可高效筛选目标菌株或评估细菌耐药性，广泛应用于科研、医疗及工业领域。

 

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