细菌的转化与平板筛选的关键步骤及影响因素与注意事项！

 

细菌转化和平板筛选是分子生物学中用于将外源DNA导入细菌并筛选成功转化体的关键技术。以下是详细步骤和注意事项：

 

一、细菌转化

 

1、定义：将外源DNA（如质粒）导入细菌细胞内，使其获得新遗传特性的过程。

 

2、关键步骤：

 

（1）制备感受态细胞：

 

常用化学法或电击法使细胞膜通透。

 

感受态细胞处于可吸收DNA的“敏感”状态。

 

（2）DNA导入：

 

化学转化：DNA与感受态细胞冰浴混合 → 42热激（90秒）→ 冰浴恢复。

 

电击转化：高压电脉冲短暂击穿细胞膜，促进DNA进入。

 

（3）恢复培养：

 

加入LB培养基，37摇床培养1小时，使抗性基因表达。

 

3、影响因素：

 

感受态细胞质量（效率：化学法约10-10 CFU/μg，电击法可达10-10¹）。

 

DNA纯度及浓度（推荐10-100 ng DNA）。

 

热激/电击条件优化（时间、温度、电压）。

 

二、平板筛选

 

1、原理：利用质粒携带的抗生素抗性基因筛选转化成功的细菌。

 

2、步骤：

 

（1）涂布平板：

 

将转化后的菌液涂布于含抗生素（如氨苄青霉素）的琼脂平板。

 

37倒置培养12-16小时。

 

（2）菌落观察：

 

成功转化的细菌形成单菌落，未转化菌被抑制。

 

3、进阶筛选方法：

 

蓝白斑筛选（α互补）：

 

质粒含LacZ基因片段，插入外源DNA破坏其功能。

 

在含X-gal的平板上，未插入DNA的菌落呈蓝色，插入的为白色。

 

4、注意事项：

 

抗生素浓度需准确（如氨苄青霉素100 μg/mL）。

 

避免交叉污染（阴性对照：不加DNA的菌液涂板）。

 

菌落过密时需稀释菌液后重新涂布。

 

三、验证与优化

 

1、阳性对照：使用已知质粒验证转化效率。

 

2、质粒鉴定：

 

挑取单菌落扩大培养后提取质粒。

 

通过PCR、酶切或测序确认插入片段正确性。

 

3、常见问题：

 

无菌落：检查抗生素有效性、DNA质量、感受态细胞活性。

 

假阳性：优化蓝白斑条件或增加双抗生素筛选。

 

四、总结

 

细菌转化与平板筛选是基因克隆的核心步骤，需严格操作条件并合理设计对照。通过抗性筛选和辅助方法可高效获得重组菌，为后续研究奠定基础。

 

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