厌氧性细菌鉴别技术的形态学与生化反应及传统培养！

 

百欧博伟生物：厌氧性细菌的鉴别技术涉及多种传统和现代方法，结合微生物学、分子生物学及生物化学手段。以下是主要鉴别技术的系统总结：

 

一、传统培养与形态学鉴定

 

1、厌氧培养技术

 

厌氧环境创建：使用厌氧罐配合产气袋或厌氧工作站，维持O浓度<1%。

 

选择性培养基：

 

含还原剂（如半胱氨酸、硫乙醇酸盐）的液体或固体培养基（如GAM培养基、CDC厌氧血琼脂）。

 

添加抗生素抑制需氧菌生长（如卡那霉素/万古霉素血琼脂）。

 

培养观察：严格厌氧菌仅在深层或厌氧区生长，微需氧菌可能靠近有氧区。

 

2、形态学与染色

 

革兰染色：初步区分革兰阳性（如梭菌属 Clostridium）与阴性（如拟杆菌属 Bacteroides）。

 

芽孢染色（如孔雀绿染色）：鉴定产芽孢厌氧菌（如艰难梭菌 C. difficile）。

 

显微镜观察：形态（杆状、球状）、排列方式（链状、成簇）等特征辅助鉴别。

 

二、生化反应鉴定

 

1、生化试验

 

代谢产物分析：检测短链脂肪酸（如丙酸、丁酸）的气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）。

 

酶活性检测：

 

API 20A系统：通过20项生化反应（如明胶液化、糖发酵）鉴定常见厌氧菌。

 

产吲哚、硝酸盐还原试验：区分拟杆菌属与其他革兰阴性厌氧菌。

 

2、抗生素敏感性

 

甲硝唑（灭滴灵）敏感性测试：多数严格厌氧菌对甲硝唑敏感，而耐药的可能是微需氧菌。

 

三、分子生物学技术

 

1、16S rRNA基因测序

 

黄金标准：通过PCR扩增16S rRNA基因并测序，比对数据库鉴定至种水平。

 

引物设计：通用引物或厌氧菌特异性引物提高灵敏度。

 

2、荧光原位杂交（FISH）

 

使用种属特异性荧光探针（如针对脆弱拟杆菌 B. fragilis 的探针）直接检测临床样本中的厌氧菌。

 

3、多重PCR与实时定量PCR（qPCR）

 

针对毒力基因（如艰难梭菌的毒素基因 tcdA/tcdB）或耐药基因（如拟杆菌属的 cfxA）快速检测。

 

四、质谱技术（MALDI-TOF MS）

 

1、原理：通过细菌蛋白质谱与数据库比对实现快速鉴定（数分钟内）。

 

2、优势：无需纯培养（部分系统支持直接涂片），但对部分厌氧菌（如梭菌属）的数据库覆盖仍需完善。

 

五、宏基因组测序与代谢组学

 

1、宏基因组测序

 

直接对样本DNA进行高通量测序，无需培养，可检测不可培养的厌氧菌（如部分口腔或肠道共生菌）。

 

2、代谢组学

 

分析厌氧菌特有的代谢产物（如丁酸、硫化氢）辅助鉴定。

 

六、临床样本处理注意事项

 

1、标本采集：避免接触氧气（使用厌氧转运瓶或含还原剂的拭子）。

 

2、快速处理：样本需在30分钟内接种，防止氧气暴露导致细菌死亡。

 

七、技术选择建议

 

场景             推荐技术

 

常规临床诊断     MALDI-TOF MS + 快速生化试验

 

疑难菌株鉴定     16S rRNA测序 + 表型分析

 

研究或不可培养菌分析  宏基因组测序 + 单细胞基因组学

 

八、总结

 

厌氧菌鉴定需结合传统培养与现代技术，分子生物学方法显著提升了准确性和效率，但传统生化试验在资源有限条件下仍具价值。临床应用中需特别注意样本处理以避免假阴性结果。

 

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