细菌数量的测定方法与工作原理及操作步骤与适用场景！

 

细菌数量的测定是微生物学研究和应用中常见的实验操作，以下是几种常用的测定方法及其原理、优缺点和适用场景：

 

一、平板计数法（活菌计数法）

 

原理：将稀释后的菌液接种到固体培养基中，每个活菌在适宜条件下形成一个可见的菌落，通过统计菌落数（CFU，菌落形成单位）推算原始菌液浓度。

 

步骤：

 

梯度稀释菌液（通常为10倍系列稀释）。

 

涂布或倾注平板。

 

培养后计数30-300个菌落的平板。

 

计算：CFU/mL = 菌落数 × 稀释倍数 / 接种体积（mL）。

 

优点：直接测定活菌数量，结果较准确。

 

缺点：耗时长（需培养24-48小时），无法区分细菌团块或死菌。

 

适用场景：实验室常规活菌计数（如水质检测、食品微生物检验）。

 

二、血球计数板法（显微镜直接计数法）

 

原理：利用特制的血球计数板，在显微镜下直接计数固定体积中的细菌总数（包括死菌和活菌）。

 

步骤：

 

将菌液稀释至适当浓度（避免过密）。

 

加样至计数板，静置使细菌沉降。

 

显微镜下观察并计数特定区域的细菌数。

 

计算：细菌数/mL = 平均每小格细菌数 × 稀释倍数 × 10。

 

优点：快速（约30分钟），无需培养。

 

缺点：无法区分死/活菌，高浓度菌液需稀释，小细胞细菌（如球菌）难观察。

 

适用场景：快速估算总菌数（如酵母或大型细菌）。

 

三、比浊法（光密度法，OD值法）

 

原理：利用分光光度计测量菌液浊度（吸光度），通过标准曲线将吸光度转换为细菌浓度。

 

步骤：

 

预先建立OD值与活菌数的标准曲线。

 

测量未知样品的OD值，通过标准曲线换算浓度。

 

优点：快速（1-2分钟），适合动态监测（如细菌生长曲线）。

 

缺点：需标准曲线，受菌体大小、聚集状态影响，无法区分死/活菌。

 

适用场景：实验室中实时监测细菌生长（如摇瓶培养）。

 

四、流式细胞术（Flow Cytometry）

 

原理：通过荧光染料标记细菌（如PI区分死/活菌），利用流式细胞仪快速检测并计数。

 

优点：高精度，可区分死菌和活菌，适用于复杂样本。

 

缺点：设备昂贵，需专业操作。

 

适用场景：科研或医学中高精度分析（如血液样本）。

 

五、最大可能数法（MPN法）

 

原理：通过统计学方法，根据细菌在系列稀释液中的生长情况（如产气、浑浊）估算原始菌液浓度。

 

步骤：设计3-5个稀释梯度，记录阳性管数，查MPN表获得结果。

 

优点：适合无法在平板上生长的细菌（如某些厌氧菌）。

 

缺点：准确性较低，耗时长。

 

适用场景：水质或环境样本中特定菌的估算。

 

六、分子生物学方法

 

原理：通过定量PCR检测细菌DNA中特定基因的拷贝数，推算菌量。

 

优点：高灵敏度和特异性，可检测不可培养的细菌。

 

缺点：成本高，需DNA提取和标准品。

 

适用场景：环境微生物组研究或病原体检测。

 

七、选择方法的依据

 

目的：需活菌数（平板计数）或总菌数（比浊法、血球计数板）？

 

时间：快速（比浊法）或允许培养（平板计数）？

 

设备：是否具备分光光度计、流式细胞仪等？

 

样本特性：浓度高低、是否浑浊、有无杂质？

 

八、注意事项

 

平板计数法需选择合适稀释度（30-300个菌落/平板）。

 

比浊法需定期校准标准曲线（不同菌株的OD值与CFU关系不同）。

 

血球计数板需避免气泡或细胞重叠。

 

根据实验需求选择合适方法，必要时可结合多种技术验证结果！

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！