细胞株构建的核心流程与注意事项及常见问题与解决方案！

 

百欧博伟生物：细胞株构建是分子生物学和细胞生物学研究中常用的技术手段，主要用于稳定表达特定基因（如荧光蛋白、功能蛋白或shRNA等）的细胞系。以下是其核心流程及注意事项：

 

一、细胞株构建核心流程

 

1、实验设计

 

选择宿主细胞：根据实验目的选择适合的细胞系（如HEK293、CHO、HeLa等），需考虑细胞的转染效率、增殖速度和代谢特性。

 

目的基因设计：构建目标基因（如过表达、敲除或突变体），需包含启动子（如CMV强启动子）、筛选标记（如Puromycin抗性基因、Neomycin抗性基因）及报告基因（如GFP）。

 

转染方法选择：根据细胞类型选择脂质体转染、电穿孔、病毒载体（慢病毒/逆转录病毒）或CRISPR-Cas9系统。

 

2、载体构建

 

克隆目的基因：将目标基因插入表达载体，通过酶切连接、Gibson组装或CRISPR定向整合。

 

验证载体正确性：通过测序、限制性酶切或PCR确认载体结构。

 

3、转染

 

瞬时转染：快速验证基因表达（24-72小时），但无法获得稳定细胞株。

 

稳定转染：

 

将载体导入宿主细胞，随后通过抗生素筛选富集成功整合外源基因的细胞。

 

病毒转染需先包装病毒颗粒，再感染靶细胞。

 

4、筛选与单克隆化

 

抗生素筛选：持续施加选择性压力（通常7-14天），淘汰未转染的细胞。

 

单克隆分离：

 

有限稀释法：将细胞稀释至0.5-1个/孔接种于96孔板，确保单克隆来源。

 

流式分选：利用荧光报告基因（如GFP）分选单细胞。

 

扩大培养：挑选高表达单克隆扩增至6孔板、培养瓶。

 

5、验证

 

基因组水平：PCR或qPCR检测外源基因整合。

 

转录水平：RT-qPCR验证mRNA表达。

 

蛋白水平：Western blot、免疫荧光或流式细胞术检测目标蛋白表达。

 

功能验证：根据基因功能设计实验（如酶活性检测、细胞表型分析）。

 

6、扩增与保藏

 

冻存：将验证后的细胞株分装冻存于液氮（含10% DMSO的冻存液）。

 

稳定性检测：连续传代（如10代以上）后检测基因表达是否稳定。

 

7、表型鉴定（可选）

 

根据研究目的进行功能分析（如增殖、迁移、凋亡、代谢通路变化等）。

 

二、常见问题与解决方案

 

 

三、注意事项

 

严格无菌操作：避免支原体污染（定期检测）。

 

单克隆验证：务必确保单克隆来源，避免混合细胞干扰结果。

 

对照设置：包括空载体对照、未转染细胞对照及抗生素杀伤曲线实验。

 

长期稳定性：定期复苏冻存细胞验证表达一致性。

 

四、应用场景

 

基因功能研究（过表达/敲除）

 

药物靶点筛选

 

蛋白生产（如CHO细胞生产抗体）

 

疾病模型构建（如肿瘤耐药株）

 

通过上述流程，可获得稳定、均一的目标细胞株，为后续研究提供可靠工具。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！