单细胞组织解离的实验方法与实验步骤及注意事项！

 

百欧博伟生物：以下是单细胞组织解离的详细实验方法，适用于后续单细胞测序、流式细胞术或单细胞功能分析。实验步骤需根据具体组织类型（如肝脏、脑、肿瘤等）调整酶解条件。

 

一、实验前准备

 

1、试剂与耗材

 

组织保存液（如HBSS或PBS，含1% BSA或FBS，预冷至4）

 

组织解离酶（根据组织类型选择，常用酶包括胶原酶IV、透明质酸酶、DNase I、胰蛋白酶等）

 

红细胞裂解液（如ACK lysing buffer，针对含血组织）

 

细胞筛（70 μm、40 μm尼龙滤网）

 

离心管、冰盒、镊子、手术剪、培养皿（预冷）

 

台盼蓝或AO/PI染料（细胞活性检测）

 

2、仪器

 

恒温水浴摇床（37）

 

离心机（4预冷）

 

显微镜（评估细胞状态）

 

生物安全柜（无菌操作）

 

3、安全措施

 

无菌操作（全程在生物安全柜内进行）

 

戴手套、口罩，避免样本污染

 

二、实验步骤

 

1、组织获取与预处理

 

取材：快速获取新鲜组织（<30分钟），置于预冷的组织保存液中（4运输）。

 

清洗：用预冷PBS冲洗3次，去除血液和杂质。

 

剪切：用无菌手术剪将组织剪成1-3 mm³小块（越小越好，增加酶解效率）。

 

2、酶解消化

 

酶解液配制（以肿瘤组织为例，需根据组织硬度调整）：

 

HBSS + 胶原酶IV（1-2 mg/ml）  

     

+ 透明质酸酶（0.1-0.5 mg/ml）  

     

+ DNase I（10-50 U/ml）  

    

+ 2% FBS（抑制过度消化）  

 

孵育：

 

将组织块转移至酶解液中（1 g组织/5-10 ml酶解液）。

 

37摇床孵育（转速50-100 rpm，时间15-60分钟，根据组织类型调整）。

 

每隔10分钟轻吹打或用移液枪反复吹吸，加速解离。

 

3、终止消化与过滤

 

终止：加入含10% FBS的冷培养基终止反应。

 

过滤：依次通过70 μm和40 μm细胞筛，去除未解离的团块。

 

离心：4 300-500 ×g 离心5分钟，弃上清。

 

4、红细胞裂解（可选）

 

若组织含较多红细胞（如脾脏、肿瘤）：

 

加入1-2 ml红细胞裂解液，冰上裂解2-5分钟。

 

立即加入10倍体积PBS终止，离心后重悬。

 

5、细胞洗涤与评估

 

洗涤：用预冷PBS或含BSA的缓冲液洗涤2次。

 

细胞计数：用台盼蓝染色，显微镜或自动细胞计数仪评估活率（需>80%）。

 

分选前处理（如需要）：

 

使用Dead Cell Removal Kit去除死细胞。

 

标记抗体（如抗CD45去除免疫细胞）。

 

三、关键注意事项

 

1、保持细胞活性：

 

全程低温操作（除酶解步骤外）。

 

避免过度消化（可预实验确定最佳时间）。

 

2、避免细胞结团：

 

加入DNase I降解释放的DNA。

 

轻柔吹吸，避免机械损伤。

 

3、组织特异性调整：

 

脑组织：需添加神经保护剂（如BSA、抗氧化剂），缩短消化时间。

 

肝脏/胰腺：胶原酶浓度需提高至3-5 mg/ml。

 

实体瘤：可能需多步酶解（如先胶原酶后胰酶）。

 

四、常见问题与解决

 

细胞活性低：减少消化时间或降低酶浓度；预冷所有试剂。

 

细胞结块：增加DNase I浓度或过滤次数。

 

产量低：延长消化时间或机械辅助（如gentleMACS解离仪）。

 

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