培养基制备和高压蒸汽灭菌的常见问题处理与安全注意事项！

 

培养基的制备和高压蒸汽灭菌是微生物学实验中非常重要的基础操作，直接影响实验结果的可靠性。以下是详细的步骤和注意事项：

 

一、培养基的制备

 

1、材料准备

 

试剂：根据培养基配方准备所需化学试剂（如蛋白胨、牛肉膏、琼脂等）

 

容器：锥形瓶/试管（需提前清洗烘干）

 

工具：电子天平、量筒、pH计、磁力搅拌器

 

蒸馏水：确保水质纯净（电导率≤5μS/cm）

 

2、配制流程

 

（1）称量溶解：

 

准确称取各组分（误差≤±2%）

 

先加少量水溶解高浓度成分（如牛肉膏）

 

难溶成分（如琼脂）需边加热边搅拌

 

（2）定容调pH：

 

定容至终体积的80%

 

用1mol/L NaOH或HCl调节pH（灭菌后pH会下降0.2-0.3）

 

固体培养基需额外添加1.5-2%琼脂

 

（3）分装：

 

液体培养基装量≤容器体积的2/3

 

斜面培养基分装高度1.5-2cm

 

试管分装需避免管口污染

 

3、特殊处理

 

热敏感成分（抗生素、维生素）需过滤灭菌后添加

 

含碳酸氢钠的培养基需CO环境灭菌

 

二、高压蒸汽灭菌

 

1、灭菌设备准备

 

检查灭菌锅密封圈、压力表、安全阀

 

确保锅内水位在刻度线之间（建议使用去离子水）

 

预运行空载灭菌程序验证设备状态

 

2、装载规范

 

物品间距≥2cm保证蒸汽穿透

 

灭菌袋需使用专用透气包装

 

液体培养基与固体物品分锅灭菌

 

灭菌指示卡置于几何中心位置

 

3、灭菌程序

 

（1）液体培养基：

 

121（0.1MPa）灭菌20分钟

 

含糖培养基需115灭菌15分钟

 

灭菌后缓慢泄压（防止暴沸）

 

（2）固体培养基：

 

121灭菌30分钟

 

含琼脂培养基需趁热摆斜面

 

灭菌后需50-60保温防凝固

 

4、灭菌效果验证

 

化学指示卡：颜色变化至标准色

 

生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌测试

 

无菌检测：37培养48h观察是否浑浊

 

三、关键控制点

 

热穿透时间：每增加100ml液体需延长灭菌时间1分钟

 

冷空气排除：预排气至压力表指针归零后再升压

 

过热蒸汽防护：灭菌锅需定期校准，避免温度＞124

 

营养保存：含铁培养基需严格控制灭菌时间≤15分钟

 

四、常见问题处理

 

灭菌不彻底：检查蒸汽饱和度（冷空气未排净）

 

培养基浑浊：可能因灭菌后缓慢冷却导致复溶

 

琼脂不凝固：pH过低（＜5.5）或灭菌时间过长

 

颜色异常：葡萄糖焦化（需分开灭菌糖类成分）

 

五、安全注意事项

 

灭菌过程需全程监控，禁止离岗

 

卸压必须自然冷却至压力表归零

 

开启锅盖时面部避开蒸汽出口

 

每周进行灭菌锅生物监测

 

建议每次灭菌时记录关键参数（温度、压力、时间、装载量），建立完整的追溯体系。对于特殊培养基（如细胞培养基、选择性培养基），应参考ATCC或DSMZ的标准灭菌方案。

 

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