细胞室培养支原体污染的处理方法与操作步骤及建议！

 

细胞培养中出现支原体污染是一个常见但严重的问题，因为支原体难以检测且容易扩散。以下是处理支原体污染的步骤和建议：

 

一、确认污染

 

1、检测方法：使用特异性检测手段（如PCR、支原体检测试剂盒、荧光染色或DNA染色法）确认污染。

 

2、常见迹象：细胞生长缓慢、培养基pH异常（频繁变黄）、细胞形态改变，但普通显微镜下难以直接观察到支原体。

 

二、立即隔离污染源

 

1、停止操作：暂停所有涉及污染细胞的操作，避免交叉污染。

 

2、隔离物品：将污染的细胞、培养基、耗材单独存放，并贴上明显标签。

 

3、专用区域：污染区域应与其他培养区分开，操作时佩戴手套并更换实验服。

 

三、处理被污染的细胞

 

1、直接丢弃：支原体极难彻底清除，建议将污染的细胞高压灭菌后废弃，尤其是珍贵细胞可通过冻存后单独标记隔离。

 

2、尝试清除（风险较高）：

 

抗生素处理：使用支原体清除试剂（如Plasmocin™、BM-Cyclin），但可能需持续数周，且可能改变细胞特性。

 

联合用药：大环内酯类（如泰乐菌素）联合四环素类抗生素，需严格验证清除效果。

 

四、彻底清洁实验室环境

 

1、消毒剂处理：用含5%过氧化氢、0.5% Triton X-100或专用支原体清除剂（如MYP™）擦拭超净台、培养箱、冰箱等。

 

2、紫外线照射：对操作台、培养箱内部进行30分钟以上紫外照射。

 

3、高压灭菌：污染的吸头、培养瓶等耗材需高压灭菌（121, 30分钟）。

 

4、熏蒸消毒：严重污染时，可用甲醛或过氧化氢蒸汽熏蒸实验室。

 

五、更换试剂与耗材

 

1、丢弃可疑试剂：污染的培养基、胰酶等液体需灭菌后废弃。

 

2、分装使用：新试剂应分装成小份，避免反复使用同一瓶试剂导致污染扩散。

 

3、滤器灭菌：支原体可通过0.1-0.2 μm滤膜，需确保滤膜完好且灭菌彻底。

 

六、预防未来污染

 

1、严格无菌操作：

 

操作时佩戴口罩、手套，定期更换实验服。

 

避免徒手接触培养瓶口或吸管尖端。

 

使用带滤芯的枪头。

 

2、定期检测：对新购入细胞、长期培养细胞每1-2个月进行一次支原体检测。

 

3、分区域操作：将细胞培养、试剂配制、污染物处理分不同区域进行。

 

4、预防性抗生素：可短期使用支原体抑制剂（如Plasmocin™ Prophylactic），但长期使用可能掩盖污染。

 

七、其他注意事项

 

1、交叉污染风险：若同一实验室其他细胞株可能暴露，需全面检测所有细胞。

 

2、细胞来源管理：从可靠机构获取细胞，避免引入污染源。

 

3、人员培训：加强实验室成员的无菌意识，定期演练污染处理流程。

 

总结：支原体污染难以完全清除，重点在于快速隔离、彻底消毒和严格预防。若污染范围广或涉及珍贵细胞，建议寻求专业生物安全团队协助处理。

 

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