犬软骨细胞常用永生化方法与操作流程及注意事项！

 

犬软骨细胞永生化是指通过基因工程手段使原代犬软骨细胞突破复制衰老限制，获得无限增殖能力，从而建立稳定的细胞系。这在软骨生物学研究、骨关节炎模型构建、药物筛选等领域具有重要意义。以下是相关技术要点和注意事项：

 

一、常用永生化方法

 

1、SV40大T抗原

 

原理：通过逆转录病毒/慢病毒载体导入SV40病毒Large T抗原基因，抑制p53和Rb蛋白，解除细胞周期阻滞。

 

特点：转化效率高（约70%），但需注意潜在致瘤性

 

2、hTERT端粒酶激活

 

方法：转染人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因，维持端粒长度

 

优势：遗传稳定性较好，致瘤风险相对较低

 

3、癌基因组合

 

常用组合：c-Myc + Ras + SV40 T抗原

 

效率：可获得高增殖活性，但需严格生物安全控制

 

4、CRISPR/dCas9表观调控

 

新技术：通过基因编辑激活内源性端粒酶表达

 

优势：避免外源基因插入，更接近天然状态

 

二、操作流程示例（以慢病毒载体为例）

 

1、原代细胞分离：从幼犬关节软骨中通过II型胶原酶消化获得

 

2、病毒转导：MOI=5-10的SV40 T抗原重组慢病毒感染P2代细胞

 

3、筛选：加入嘌呤霉素（2μg/mL）持续筛选2周

 

4、单克隆化：有限稀释法获得单克隆细胞系

 

5、验证：

 

增殖曲线（PD>50代）

 

端粒酶活性检测（TRAP法）

 

核型分析（维持犬2n=78染色体）

 

软骨表型检测（II型胶原、Aggrecan免疫荧光）

 

三、功能维持关键

 

1、3D培养验证：在藻酸盐或琼脂糖中应保持球形生长特性

 

2、基质分泌能力：GAG含量应≥15μg/10^6 cells（比色法）

 

3、力学响应：对流体剪切力（5-15 dyn/cm²）保持代谢应答

 

四、典型应用案例

 

1、骨关节炎模型：永生化细胞经IL-1β刺激后，MMP-13表达上调5-8倍

 

2、基因治疗研究：作为AAV载体转导的效率测试模型（感染率可达90%）

 

3、支架材料测试：与PLGA支架共培养21天后形成类软骨组织（压缩模量≥0.4MPa）

 

五、注意事项

 

1、需定期检测支原体污染（建议每月用PCR法检测）

 

2、传代密度应保持30-80%汇合度，避免过度融合导致去分化

 

3、推荐使用含10% FBS + 1% ITS + 50μg/mL抗坏血酸的专用培养基

 

4、商业化资源：ATCC现有犬软骨细胞系（如C2-10）可供对比研究

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！