微生物实验室常见细胞培养污染判别及应对措施有哪些？

 

百欧博伟生物：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃。决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识，操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好。

 

一般情况下，如果你的细胞被细菌污染了，培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化，表现为胞浆中出现大量的颗粒，液体浑浊、培养基PH下降，变成黄色，贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡；而受到真菌污染的细胞，细胞状态并不会马上发生变化，培养3-4天后，可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿。

 

一、常见细胞培养污染判别

 

1、真菌污染

 

真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。

 

2、细菌污染

 

污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

 

3、支原体污染

 

支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3-0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。

 

细胞培养的支原体污染来源主要有

 

(1)细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；

 

(2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

 

(3)细胞培养用的组分，如血清、培养液等；

 

4、黑胶虫污染

 

黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

 

二、常见细胞培养污染判别及应对措施

 

细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、支原体、黑胶虫、病毒和交叉污染等，每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。下面就具体看看每一种污染。

 

1、细菌污染(较容易被发现)

 

引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；

 

细菌污染种类：白色葡萄球菌，大肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；

 

（1）细胞污染后的变化

 

污染后由于有大量酸性物质产生，因此培养基会短时间内由红色变为黄色；

 

由于细菌大量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物；

 

普通倒置显微镜高倍镜观察，胞浆内可见大量颗粒(如下图红色箭头)；

 

细胞生长缓慢，逐渐变圆脱落。

 

如下图所示：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远大于杆状细菌，而细菌呈黑色颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。

 

（2）处理措施

 

在培养液中添加双抗(P/S)处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；

 

另外添加西司他丁钠和亚胺培南(泰能)处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况。

 

裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。

 

2、霉菌污染(较容易被发现)

 

引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；

 

污染种类：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；

 

（1）细胞污染后的变化

 

一般来说，培养液不会变浑浊；

 

比较容易发现，肉眼可见点状菌落(淡黄色或者白色)漂浮在培养基表面(如下图左)；

 

普通倒置显微镜下观察，可见絮状交错的菌丝或菌团生长在细胞之间；有时真菌并不是直接分布于细胞贴壁层，需要通过调整显微镜仔细观察寻找菌丝或菌团(如下图右)。

 

如下图所示：悬浮细胞U397的霉菌污染，黄色圆形发亮的是U397；红色箭头：霉菌的菌丝和孢子囊，特别的是孢子释放出来后是难以被酒精杀死。

 

（2）处理措施

 

添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；

 

环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。

 

若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。

 

3、支原体污染(难被发现)

 

支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤器，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高。由于支原体可以与细胞共存，生长速率受影响较小，而被忽视。支原体污染在细胞培养污染中最为隐蔽和最难察觉，但是支原体能明显影响宿主细胞代谢、RNA合成及基因表达的作用，因此越来越受到重视。

 

引起原因：主要来源于是已感染支原体细胞之间的交叉污染，支原体感染的血清和胰酶等；

 

（1）细胞污染后的变化

 

培养液不变浑浊，但会很快变成黄色；

 

多数细胞在形态方面少有明显变化；

 

在倒置显微镜下可见胞浆出现小颗粒或空泡；

 

（2）处理措施

 

定期用支原体试剂盒检测；

 

换液可以减缓污染情况，但无法根除；

 

支原体清除试剂盒可以达到较好效果；

 

小鼠腹腔巨噬细胞清除法。

 

4、黑胶虫污染

 

引起原因：往往来源于血清；

 

（1）细胞污染后的变化

 

低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可见到其做布朗运动，像小虫游来游去；

 

细胞培养液仍然清亮，污染较轻时对细胞无影响；若太多就会对细胞造成影响。

 

（2）处理措施

 

更换血清；增加细胞密度，提高细胞的生长率。

 

5、病毒污染

 

引起原因：病毒可能来自于血清；

 

（1）细胞污染后的变化

 

污染后培养液无明显变化；

 

大部分细胞也不会有明显的形态变化；

 

6、交叉污染

 

引起原因：两种或两种细胞以上的实验同时进行，实验器具、试剂等混用而易造成的污染；

 

检测手段：可通过镜检观察细胞形态是否与所培养细胞形态一致来判断，另外还可以通过各种免疫学试验、同功酶分析及细胞遗传学方法来确定。

 

处理方式：针对病毒和交叉污染较难清除，建议丢弃细胞重新培养；

 

学会对各种污染情况的辨别和处理是一项不可或缺的实验技能，希望大家在看完我们的文章后结合你的实验操作，学会如何应对细胞污染。

 

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