胰酪大豆胨液体培养基(TSB)适用性检查与操作方法！

 

一、培养基原理

 

胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物提供微生物生长所需的基本氮源和碳源，葡萄糖提供碳源，氯化钠提供适宜的生理环境，磷酸氢二钾提供缓冲环境以缓解细菌因发酵葡萄糖而产生的酸对pH的影响。

 

二、所需菌种

 

分三种情况：

 

A.用于无菌检查

 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]

 

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

 

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]

 

B.用于MPN法细菌计数

 

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]

 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]

 

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]

 

C.用于微生物限度检查

 

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

 

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]

 

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]

 

乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]

 

三、检查方法

 

试管接种法，进行促生长能力检查。

 

四、菌液制备与稀释

 

1、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌

 

挑取四代以内（含四代）上述菌种的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35培养18～24h，使用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠溶液进行十倍稀释，制成每1ml含小于100cfu的菌悬液。

 

(稀释梯度：通常情况下为10-6～10-7、枯草芽孢杆菌10-5～10-6)

 

2、白色念珠菌

 

挑取四代以内（含四代）的白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25培养2～3天；使用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠溶液进行十倍稀释，制成每1ml含小于100cfu的菌悬液。

 

(稀释梯度：通常情况下为10-6～10-7)

 

3、黑曲霉

 

挑取四代以内（含四代）的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面中，经20～25培养5～7天（生长大量黑色菌丝）,加入5ml含0.05%聚山梨脂80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。使用含0.05%聚山梨脂80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或含0.05%聚山梨脂80的0.9%氯化钠溶液进行十倍稀释，制成每1ml含小于100cfu的菌悬液。

 

(稀释梯度：通常情况下为10-5～10-6，因菌丝数量不同，可能有误差)

 

五、培养基制备

 

被检培养基：称取培养基30.0g于1000ml纯化水中,微温溶解，分装试管，121高压灭菌15分钟,冷却，备用。

 

另准备胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基进行稀释菌悬液计数，培养基灭菌后置于44.5水浴保温待用。

 

六、实验方法

 

1、培养基阳性组：取稀释后的各试验菌悬液1ml分别加于预先制备的试管培养基中，每种细菌接种两支试管。同时分别取1ml菌悬液加于无菌空平皿中，用于计数，每种细菌做两个平板。

 

2、培养基阴性组：即空白对照，即不添加菌液。

 

3、接种量计数：步骤1中的平皿中，细菌倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，霉菌和白色念珠菌倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。同时每种培养基做1个空白。

 

4、培养条件：

 

无菌检查：20～25培养14天或直至出现浑浊（不超过14天）

 

MPN计数：30～35培养箱中培养3天

 

控制菌检查：30～35培养箱中培养18～24小时

 

倾注计数用的的胰酪大豆胨琼脂培养基平板置30～35培养箱中培养3天

 

倾注计数用的沙氏葡萄糖琼脂培养基平板置20～25培养箱中培养3～5天

 

七、观察记录方法

 

参考下述，长情况

 

A.金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌

 

——TSB试管浑浊，生长良好。

 

B.枯草芽孢杆菌

 

——TSB试管浑浊，有片状菌团出现

 

C.铜绿假单胞菌

 

——TSB试管浑浊，培养基液面有菌膜生长。

 

D.白色念珠菌

 

——TSB试管澄清透明，底部有白色菌团。

 

E.黑曲霉

 

——TSB试管澄清透明，有白色或黑色菌丝团生长。

 

F.接种量计数＝计数培养基平均菌落数—计数培养基空白组菌落数

 

八、判定依据

 

接种量在<100CFU,加菌的培养基试管生长良好且与对照培养基相似，空白管无菌生长，则判定合格。