奥哈芽孢杆菌的培养方法与实验内容及使用范围！

奥哈芽孢杆菌是Bacillus属的微生物，原产地为中国。产芽孢革兰氏阳性杆菌。主要用途为研究。具体用途为潜在的有机污染物降解菌/分离自草甘膦富集菌群。

一、菌种简介

平台编号：Bio-05285

提供形式：冻干物

拉丁属名：Bacillus Okhensis

中文译名：奥哈芽孢杆菌

拉丁学名：Bacillus okhensis

原始编号：ZJ1227

菌株来源：←国家海洋局第二海洋研究所

保藏人：许学伟

直接来源国家：中国

保藏时间：9/17/2008

其他保藏编号

生物危害：四类

模式菌株：非模式菌株

菌株用途：研究

培养温度：28

培养基：0223    

其他培养条件

分离源：海水

采集地点：东海

采集国家：中国

用途：教学，研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、培养方法

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。

6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

三、实验内容

1、称量→溶化→调ph→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查

2、干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物

3、高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查

4、过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌

四、使用范围

（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

五、保藏方法

1、传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3、载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4、寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5、冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速冻结（约-70）和液氮（-196）等保藏法。

6、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用 0.1-0.2ml 的培养液或无菌水溶解，接种在 2 支斜面上，因冻干粉处于休眠状态，请勿接种多支斜面或平板，以避免因接种量不足而导致复苏不成功；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。