小鼠肝癌细胞的培养方法与操作步骤及应用研究！

一、背景

H22小鼠肝癌细胞是一种常用的实验细胞株，主要用于科学研究。这些细胞是从小鼠腹水中分离出来的，由大连医科学院建立。H22小鼠肝癌细胞的特性包括淋巴母细胞的形态和悬浮生长的特点。它们通常用于科研目的，不适用于临床诊断或治疗。

二、H22小鼠肝癌细胞的培养方法和步骤如下：

培养基准备：通常使用RPMI-1640培养基，加入10%的优质胎牛血清和1%的双抗。

培养条件：在37摄氏度的培养箱中，保持95%的空气和5%的二氧化碳，湿度为70%-80%。

冻存液：冻存液的配方通常是90%血清和10%的二甲基亚砜（DMSO）。

冻存方法：将细胞沉淀消化并离心后，加入配置好的冻存液轻轻重悬细胞，然后转入程序冻存盒，放入-80度冰箱过夜，第二天转入液氮保存。

复苏方法：将冻存管在37水浴中迅速完全融化，然后转移到无菌离心管中离心，最后用完全培养基重悬细胞并接种到新的培养瓶中。

三、在使用H22小鼠肝癌细胞时，需要注意以下几点：

冻存细胞的复苏：将冻存管在37水浴中迅速完全融化，然后转移到无菌离心管中离心，最后用完全培养基重悬细胞并接种到新的培养瓶中。

细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可以进行传代培养。对于悬浮细胞，传代时可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态。

运输和保存：冻存细胞通常通过干冰运输，并在收到后立即复苏或转移到液氮中保存。冻存细胞转入液氮后应及时复苏一管检查冻存活性，若有异常，及时调整实验方案。

培养操作：细胞培养需要在生物安全柜台中进行操作，并严格遵守无菌操作。在培养液中加入适量青霉素-链霉素溶液以防止可能的细菌污染。

法规遵守：接收、处理、保存、丢弃及使用细胞时，要遵守相关法律法规，充分考虑可能存在的风险和责任，采取适当的安全和处理措施尽量降低对健康或环境的危害

四、应用

H22小鼠肝癌细胞可以用于益气解毒方含药血清对小鼠肝癌H22细胞体外增殖的影响：

本实验采用血清药理学方法观察益气解毒中药对体外培养的H22小鼠肝癌细胞增殖的影响,探讨益气解毒中药在抗肝癌治疗中的作用机制,为肝癌的中医药治疗开辟一条新的路径。

方法：取健康大鼠10只,连续4天以1.25g/ml生药的浓度将益气解毒方提取液按10ml/kg的剂量灌胃,于末次给药后1小时以0.9%戊巴比妥钠5ml/kg腹腔注射麻醉,无菌条件下腹主动脉采血,离心、灭活、分装、-80保存备用;以相同方法连续4天等剂量生理盐水灌胃,制备阴性对照组血清。

将体外培养的H22小鼠肝癌细胞分成5组：阴性对照组、阳性对照组(氟尿嘧啶)、益气解毒中药高、中、低剂量组。经倒置显微镜观察各组含药血清对体外培养的H22小鼠肝癌细胞的生长状态及形态的影响;通过MTT法、CCK-8法检测含药血清对H22细胞增殖抑制的影响;通过流式细胞仪法检测含药血清对H22细胞生长周期抑制的影响;采用RT-PCR方法研究含药血清对体外培养的H22小鼠肝癌细胞增殖抑制的细胞凋亡相关蛋白的影响。

结果：益气解毒中药含药血清对体外培养的H22小鼠肝癌细胞的增殖在不同浓度均产生一定的抑制作用。对体外培养的H22小鼠肝癌细胞的形态及生长状态具有抑制作用;对体外培养的小鼠肝癌H22细胞增殖有抑制作用,对细胞的抑制率增高;对体外培养的小鼠肝癌H22细胞生长周期有抑制作用,主要表现在对细胞G0/G1期的抑制;对体外培养的小鼠肝癌H22细胞凋亡相关蛋白有一定影响,使Bcl-2表达下调,Bax表达上调。

结论：通过实验可见益气解毒中药含药血清对体外培养H22小鼠肝癌细胞的增殖具有抑制作用。作用的机制可能与通过影响H22小鼠肝癌细胞分裂周期的G0/G1期和调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达有关。