大鼠肾系膜细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

大鼠肾系膜细胞是从大鼠的肾小球组织中分离出来的细胞。这些细胞在肾脏中起着重要的作用，它们位于肾小球的中轴区，分布于毛细血管簇中的毛细血管之间。大鼠肾小球系膜细胞的主要功能包括维持肾小球毛细血管网结构的完整性，调节肾小球滤过率，以及分泌多种细胞生长因子如转化生长因子β、血小板源性生长因子以及肾素等生物活性物质，从而发挥多种生物学功能。

在细胞培养方面，大鼠肾小球系膜细胞通常使用DMEM培养基，并添加10%胎牛血清和1%双抗（包括青霉素和链霉素）。培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳和饱和湿度。细胞呈贴壁生长，形态上皮细胞样。

二、大鼠肾系膜细胞培养操作

1)复苏大鼠肾系膜细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠肾系膜细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠肾系膜细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

大鼠肾系膜细胞可以用于肾安号对大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1、HGF表达影响的实验研究：

通过对大鼠肾系膜细胞的体外培养,观察肾安号对大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1和HGF表达的影响,进而探讨其阻缓肾纤维化的可能作用机制。

方法：

1、应用体外细胞培养技术,进行大鼠肾系膜细胞培养,并选择脂多糖为刺激物。

2、在体外培养的大鼠肾系膜细胞中,按不同分组:正常组（普通培养液）;LPS组（含LPS的培养液）;肾安组（含肾安号的培养液）,分别加入不同培养液,于培养24小时和48小时后在显微镜下进行细胞生长的形态学观察。

3、用台盼蓝染色计数法测含不同浓度肾安号培养液培养条件下的大鼠肾小球系膜细胞的细胞活力,观察肾安号对大鼠肾系膜细胞的毒性作用,从而确定实验用含肾安号培养液的合理浓度。

4、在体外培养的大鼠肾系膜细胞胞中,按不同分组:空白组,即GMC组（普通培养液）;对照组,即LPS组（含LPS的培养液）;肾安低剂量组（含低浓度肾安号的培养液）;肾安中剂量组（含中等浓度肾安号的培养液）;肾安高剂量组（含高浓度肾安号的培养液）,分别加入受试品,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法,于24小时、48小时和72小时观察各组标本中大鼠肾小球系膜细胞增殖水平,进而选择药物作用的最佳浓度及时间段。5.在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞中,按不同分组:空白组,即GMC组（普通培养液）;对照组,即LPS组（含LPS的培养液）;治疗组,即肾安组（含肾安号的培养液）,分别加入受试品,采用免疫细胞化学技术法观察各组标本中大鼠肾小球系膜细胞表达TGF-β1和HGF的情况。

结果：

1、大鼠肾系膜细胞的体外培养结果经传代培养后的大鼠肾小球系膜细胞,一般24小时全部贴壁,纯度极高,生长迅速,很快融合成片,密集时可重叠生长,2-3天即可进行传代培养。细胞培养成功且符合实验要求。

2、大鼠肾小球系膜细胞形态学观察结果在倒置显微镜下观察,可见正常组大鼠肾小球系膜细胞体积较大,且纯度极高,形态多为梭形或星形。经HE染色后,位相显微镜下见细胞结构十分清晰,胞浆内可见大量微丝样结构,核居中央,多呈圆形或椭圆形,核周胞质散布大量的细胞小颗粒。与相关文献报道一致。经LPS处理24小时后,光镜下可见LPS组大鼠肾小球系膜细胞增生明显,细胞体积增大,但附壁能力弱,易脱落,相邻细胞间连接性有所降低。48小时后大鼠肾小球系膜细胞细胞体积有所缩小,形态变圆,核固缩开始出现,核颜色加深,折光性增强。澎砖尹硬梦陀叨士矛斌必丈而经中药肾安I号处理的肾安组大鼠肾小球系膜细胞贴壁生长良好,几乎无脱落,胞浆饱满,相邻细胞生长融合成片。形态学观察与正常组一致。

3、大鼠肾系膜细胞毒性试验结果经台盼蓝染色排斥试验显示:肾安I号25%,12.5%和6.25W0浓度组24小时,48小时和72小时细胞活力均达90%以上。经XZ检验,肾安I号上述三组细胞活力与空白组比较,无显著性差异（P>0.05）。