肝片吸虫病通用PCR试剂盒的背景与应用！

一、背景

肝片吸虫病通用PCR试剂盒是一种用于检测肝片吸虫病的试剂盒。这种试剂盒采用了PCR技术，可以在短时间内对肝片吸虫病进行快速、灵敏的检测。

肝片吸虫病是一种由肝片吸虫引起的寄生虫病，主要流行于牛、羊等草食性动物中。感染后会导致动物出现营养不良、消瘦、生产性能下降等症状，严重影响畜牧业的发展。因此，使用肝片吸虫病通用PCR试剂盒对动物进行检测，可以及时发现并控制疾病的传播。

肝片吸虫病通用PCR试剂盒的原理是利用特异性引物和荧光探针，扩增肝片吸虫的DNA序列。在PCR反应中，当引物与目标DNA序列结合时，会激活DNA聚合酶进行链式反应，从而扩增出大量的目标DNA片段。荧光探针则会与扩增产物结合，通过荧光信号的检测，可以确定是否存在肝片吸虫的感染。

肝片吸虫病通用PCR试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够快速准确地检测出感染情况。它在临床上广泛应用于肝片吸虫病的诊断和治疗监测，对于指导临床治疗和预防疾病的传播具有重要意义。

二、肝片吸虫病通用PCR试剂盒的操作步骤如下

1、样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2、DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3、PCR反应体系准备：根据试剂盒说明书的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4、PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5、结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在肝片吸虫病的感染。

三、应用

肝片吸虫病通用PCR试剂盒可以用于基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立：

肝片吸虫病是由片形科(Fasciolidae)、片形属(Fasciola)的肝片吸虫(Fasciola hepatica)寄生于人和牛、羊等肝脏、胆管内,引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种寄生虫病,世界卫生组织(WHO)已将其列为重要的人兽共患病之一。

据统计,全球超过3亿只的牛、羊感染肝片吸虫,大大降低了畜产品的产量,不仅严重影响畜牧业发展,还给畜牧业带来巨大经济损失,肝片吸虫病每年造成的经济损失超过32亿美元。所以,肝片吸虫病的早期诊断以及防治尤为重要。

因此,本试验在课题组前期蛋白组学研究的基础上,用筛选到的具有作为早期诊断抗原潜力的甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)、组织蛋白酶L1(Catl-1)作为研究对象,根据Gen Bank中已发表的Fh GAPDH(THD20231.1)和Fh Catl-1(AY573569.1)序列为参考,设计两对特异性引物。提取肝片吸虫成虫总RNA,使用肝片吸虫病通用PCR试剂盒经过PCR方法扩增出了Fh GAPDH和Fh Catl-1基因,将目的基因定向克隆入p MD18-T载体中,经双酶切、肝片吸虫病通用PCR试剂盒PCR扩增及质粒测序鉴定正确后,表明成功克隆了Fh GAPDH和Fh Catl-1基因。

序列分析结果显示:Fh GAPDH基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为1014 bp,编码337个氨基酸;Fh Catl-1基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为981 bp,编码326个氨基酸。生物信息学分析结果显示:Fh GAPDH蛋白质等电点为7.65,为碱性氨基酸,亲水性平均系数小于零,B细胞抗原表位分析其具有良好的抗原性,属亲水性蛋白,主要以α螺旋和无规则卷曲为二级结构,且该蛋白不存在信号肽和跨膜区域,空间结构预测结果显示模板与序列一致度为71.99%,GMQE可信度良好,QMEAN4匹配度高度一致。

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